★ 张雪莲 陈芳有 罗永明

(江西中医药大学 江西 南昌 330004)

分子印迹技术(molecular imprinting technology, MIT)的研究历史由来已久，可以追溯到上个世纪40年代，著名的诺贝尔奖获得者Pauling提出了以抗原为模板合成抗体的理论，这是最早从免疫学角度对分子印迹技术的最初描述。但是很长一段时间并未被人重视，直到1972年Wullf等合成出几种对糖类和氨基酸衍生物具有较高选择性的高分子化合物，并将它们用作高效液相色谱的固定相，首次提出了“分子烙印技术”这个概念，这项技术才逐渐被人认识。经过此后几十年的迅速发展，分子印迹技术已在很多领域有广泛的应用，比如在手性化合物的拆分、仿生传感器、固相萃取、抗体模拟、酶催化模拟、污染物分析以及控释药物等领域[1,2]。本文主要综述MIT的基本原理、类型、制备方法以及在中药研究中的应用进展。

1 MIT的基本原理

MIT是指制备对特定某一目标分子具有特异选择性的聚合物，即分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer, MIPs)的过程，常被形象地描述为制造识别“分子钥匙”的“人工锁”的技术。MIPs是一种具有较强分子识别能力的新型高分子材料，具有类抗体的特异性、高选择性和高强度等优点，另外还具有天然抗体所没有的制备简单、模板分子可回收重复利用的特点。MIPs的制备过程[3]如图1所示：

图1 MIPs制备过程

2 MIT的基本类型

根据模板分子与分子印迹聚合物在聚合过程中的机理的不同，目前将分子印迹技术分为三种基本类型：共价法、非共价法和半共价法[4]。

2.1 共价法 1972年，德国的Wullf等创立共价法，也称为预组装法。功能单体首先与模板分子以共价键的形式形成单体-模板复合物，再加入交联剂形成高聚物，然后用化学方法将共价键断裂，去除聚合物中的模板分子，如此便合成出分子印迹聚合物。

2.2 非共价法 20世纪80年代，瑞典科学家Mosbach等建立非共价法，也称为自组装法。功能单体与模板分子之间自发地有序地进行组织排列，以非共价键形式自发形成具有多重作用点的单体-模板聚合物，再加入交联剂保存这种作用。相对于共价法，非共价法操作方便、简单易行，功能单体与模板分子之间作用力较弱，容易除去模板。而且，此法制成的分子印迹聚合物亲和性、选择性和分离能力都比较高。可供选择的功能单体也很广泛，是目前最常用的方法。

2.3 半共价法 1995年，Vulfson等继共价法和非共价法之后发展了一种被称为“牺牲空间法”的分子印迹技术。首先将功能单体和模板分子以共价键的形式形成单体-模板复合物，再加入交联剂形成高聚物，最后除去模板分子就形成了分子印迹聚合物。当模板分子再次与聚合物结合时，则是以非共价键的形式结合在一起。所以说，半共价法是综合了共价法和非共价法的分子印迹聚合物的制备技术。

3 MIPs的制备方法

3.1 本体聚合法 这是制备分子印迹聚合物最经典，也是最常用的一种方法。将功能单体、模板分子、交联剂、引发剂和致孔剂按一定比例在适当溶剂中溶解，置于具塞瓶中，然后进行超声、充氮、除氧，密封好后用热聚合或光聚合一定时间，即可得到块状的MIPs。再经机械粉碎、过筛，取合适粒径范围内的颗粒制成分离装置。

3.2 原位聚合法 这是一种在色谱柱中直接聚合的方法。Matsul等首次在不锈钢柱管内原位聚合制备分子印迹整体柱，以L-和D-苯丙氨酸为模板分子，再和功能单体、交联剂、引发剂等溶解后装入空的毛细管或液相色谱柱中直接进行聚合反应。

3.3 乳液聚合法 这是一种非均相溶液聚合的方法。Uezu等在1994年首次报道了水-油-水乳液体系制备微球的方法。先将模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂和乳化剂等溶于有机溶剂中，然后将溶液转移到水中，不停地搅拌使之形成乳化液，最后加入引发剂进行交联聚合反应。

3.4 悬浮聚合法 这是目前制备球形MIPs最常用的方法，其反应体系一般由功能单体、脂溶性引发剂、分散剂和水组成。先用有机溶剂将单体溶解，加到溶有稳定的水或其他强极性溶剂中，高速搅拌获得悬浊液。再加入引发剂引发获得分子印迹聚合微球。

3.5 表面印迹法 这种方法是对硅胶等一些粒子的表面进行修饰，使其带有烯烃、氨基等活性基团，从而能与聚合物键合到一起。首先将功能单体与模板分子在一定的有机溶剂中反应形成加合物，再将其和表面活化后的硅胶、三羟甲基丙烷烯酸酯粒子和玻璃介质反应形成聚合物。

4 MIT在中药研究中的应用

中药中所含的活性成分复杂，类型众多，含量较低，且不稳定，因此分离纯化有一定困难。传统的中药活性成分的分离纯化主要依赖于各种色谱方法，如硅胶柱色谱、大孔吸附柱色谱、凝胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、高效逆流色谱和制备型高效液相色谱等。它们虽然能达到分离纯化的目的，但往往存在分离时间长，需要溶剂量大，分离效率低且纯度不够等缺点。而MIT最大的特点在于其极高的选择性，这在实现快速、高效地分离纯化中药活性成分方面占有独特优势[6]。近些年，MIT在生物碱、黄酮、有机酸、多元酚类等多种中药活性成分的分离纯化方面有着广泛的研究和应用[7，8]。

4.1 生物碱类 生物碱是指存在于生物体内的碱性化合物，是中药中非常重要的一种有效成分，具有显著的生理活性，如一些生物碱具有抗肿瘤、抗癌等作用。由于其碱性，可以与酸性功能单体形成离子键或氢键，较容易合成分子印迹聚合物。

颜流水等最早便以咖啡因为模板分子，采用微柱液相色谱技术，经紫外光引发原位聚合制备出了分子印迹毛细管整体柱，结果显示其对咖啡因有高度选择性。后来陈移娇等也以咖啡因为模板分子，采用水溶液悬浮聚合法制备出微米级MIPs微球，可作为高效液相色谱(HPLC)的固定相，甚至能高效地从茶叶中分离富集咖啡因。Farrington K等也以咖啡因为模板分子合成出MIPs，并用核磁共振实验确定模板和功能单体的比例和溶剂用量，借助分子模拟探究其热力学稳定性。韦寿莲等以咖啡因作为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，制备r-咖啡因MIPs，与非印迹聚合物相比，此MIPs对咖啡因具有更高的吸附容量和选择性[9]。

早在1993年，Mosbach K等利用茶碱和甲基丙烯酸之间可键合的氢键，制成了专用于分析茶碱的色谱固定。后来Kobayashi等用湿相转化法合成了可以识别茶碱的丙烯腈-丙烯酸的MIPs，王红英等采用了相转移法也制备出了对茶碱等生物碱具有高选择性的(AN-CO-AA)高分子膜。王靖宇等采用了自由基热聚合法在PADF中孔纤维膜表面制备了茶碱的MIPs，并通过甲醇通量和SEM测试证明了MIP s表面聚合层的存在，通过膜色谱滤过实验证明了茶碱MIPs的选择性因子随原液浓度和萃取液乙酸酸度增加而降低，最重要的意义在于他们把膜色谱形式应用于茶碱和可可碱的萃取分离，这是一大创新[10]。

卢彦兵等首先采用荧光法研究了奎宁MIPs的吸附与识别特性，为中药中奎宁的分离分析提供了新方法。后来何健峰等在亲水体系中采用两步种子溶胀和微乳液聚合法，以甲基丙烯酸为功能单体，成功制备出了奎宁的球形MIPs。近年来张春静等又以奎宁为模板分子，以多孔醋酸纤维为支撑体，合成了奎宁分子印迹复合膜，并对膜的选择性和分离性能进行了研究，表明了该膜对奎宁分子具有独特的结合能力，这为奎宁和辛可宁的分离提供了可靠的技术和依据。

Dong等以麻黄碱为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，制备出的MIPs可用于固相萃取，直接从麻黄中提取出高纯度的麻黄碱。Xie J C等以哈尔曼(harman)为模板分子合成出分子印迹聚合物，可作为液相色谱-质谱联用系统的固定相，成功分离并鉴别了骆驼蓬种子甲醇提取物中两个与哈尔曼结构类似的抗癌组分：哈尔明碱(harmine)和哈马林(harmaline)。Lai J P等以苦参碱为模板分子合成的MIPs已成功应用于中药苦参中苦参碱的分离纯化。朱全红等制备出长春碱的MIPs，可以从长春花提取物中富集纯度较高的长春碱。Sambe H等利用沉淀聚合法制备出了对烟碱具有高识别能力的MIPs微球，直径约为4gm。Lin LQ等合成的青藤碱的MIPs，可作为固相萃取材料分离纯化青藤碱，平均回收率达到98%。李辉等以高三尖杉酯碱为模板，用沉淀聚合法成功制备出MIPs，且运用正交设计优化了合成条件[11]。刘韶等以甲基莲心碱为模板、a-甲基丙烯酸为单体，采用均匀设计的方法优化了甲基莲心碱MIPs的制备条件，并通过固相萃取法证明了该工艺制备的MIPs对甲基莲心碱具有较高的吸附性和选择性[12]。

4.2 黄酮类 大多数中药材中都含有黄酮类化合物，它在植物体内只有很少一部分是以游离形式存在，大多则是与糖结合形成苷类。它也具有多种生理活性，如抗炎、抗氧化、降低胆固醇、降血糖和改善血液循环等。

目前应用最多的黄酮类分子印迹聚合物，多是以槲皮素为模板、丙烯酰胺为单体制备而成。谢建春等首次用非共价键法合成了槲皮素MIPs，并直接用于银杏叶提取物水解液的分离，得到了槲皮素和与其结构相似的山奈酚。程绍玲等以葛根素为模板，丙烯酰胺为单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，成功制备了葛根素MIPs，显示出对葛根异黄酮有很好的印迹作用，可从葛根提取物中分离出葛根素、大豆苷元和大豆苷，且其提取效果远大于传统的大孔吸附树脂。张裕卿等以水溶性黄酮芦丁为模板，与具有专一识别官能团的氯丙基三乙氧基硅烷反应制备得到前驱物，再与正硅酸乙酯发生协同水解、凝胶老化和模板洗脱，最终制备出的内置型硅胶吸附剂对芦丁具有高效选择性。李礼等采用封管聚合法，以中药黄栌的主要活性成分非瑟酮为模板、丙烯酰胺为单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂合成了MIPs。并通过优化洗脱条件，用固相萃取使非瑟酮和其结构相似物槲皮素在柱上得到了较好分离。肖淑娟等以木犀草素为模板、丙烯酰胺为功能单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，合成了木犀草素MIPs，可用于固相萃取，分离出的木犀草素纯度比硅胶柱高出近20%[13]。潘浪胜等通过热引发聚合也制备出了木犀草素的MIPs，并用于固相萃取柱考察其选择性，结果显示该聚合物能够直接作为中药活性成分木犀草素的提取分离材料[14]。贺敏强等以山奈酚为模板分子、2-乙烯基吡啶为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，制备出了山奈酚的MIPs，并进行了静态平衡结合实验和吸附动力学研究，表明它对山奈酚具有很强的选择吸附特性[15]。Trotta F等早先采用相转化技术制备出了柚皮苷的分子印迹聚合薄膜，其对柚皮苷的吸附量可达0.13pmol/g。朱秀芳等合成了橙皮苷的MIPs，并对其吸附性能进行了考察[16]。李丽丽等合成了芹菜素的MIPs，并利用紫外光谱推测出聚合物的印迹机制，利用傅里叶红外光谱仪探究了聚合物的结构特征[17]。

4.3 有机酸类 已有文献报道过以绿原酸为模板、甲基丙烯酸为单体，制备出的MIPs用于金银花提取液中绿原酸活性成分的分离纯化，获得了满意的效果[18]。张华斌等也以绿原酸为模板，以多壁纳米管为基体，通过热聚合在碳纳米管表面接枝绿原酸MIPs。这种复合材料不仅具有MIPs的专一选择性识别能力，还获得了碳纳米管超强的力学及电学性能[19]。苏立强等以咖啡酸为模板、丙烯酰胺为单体，在水溶液中合成了咖啡酸的MIPs，用于色谱分离柱，结果在高效液相色谱中咖啡酸与其结构相似的绿原酸的分离度达到了1.91[20]。Zhu T等将咖啡酸的MIPs用于海角草提取物中的咖啡酸、原儿茶酸和阿魏酸三种活性成分的分离纯化，测得它们的回收率在71.08～81.02之间[21]。朱秀芳等以氢化阿魏酸为假模板分子、4-乙烯基吡啶为单体，通过自组装法在乙腈溶剂中合成了MIPs，其对阿魏酸的识别能力甚至高于氢化阿魏酸，用于川芎水提液中阿魏酸的分离纯化有较好的效果。Figueiredo EC等以儿茶酚为模板分子合成了MIPs，并建立了在线检测瓜拉那、茶叶和饮用水中儿茶酚的方法。朱林敏等以丹酚酸A为模板，以丙烯酰胺、甲基丙烯酸、2-乙烯基吡啶和4-乙烯基吡啶为单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，合成出一系列对丹酚酸A具有较高吸附性和选择性的MIPs[22]。

4.4 多元酚类 茶多酚中的儿茶素类成分结构相似，常规的分离方法难以分离出表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和其对映体没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)。钟世安等以EGCG为模板分子、甲基丙烯酸酯为单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，合成了EGCG的MIPs，并应用于固相萃取，从茶多酚提取物中分离出高纯度的EGCG，表明了MIT是一种有效的分离纯化EGCG的方法。向海燕等以白藜芦醇为模板、丙烯酰胺为单体、偶氮二异丁腈为引发剂，制备了白藜芦醇的MIPs，从虎杖提取液中分离富集出了白藜芦醇和少量白藜芦苷。洪美华等采用单步溶胀聚合法，用聚苯乙烯微球为种球，以白藜芦醇为模板，在N,N-二甲基甲酰胺体系中合成出了白藜芦醇的单分散MIPs微球[23]。王婧等以和厚朴酚为模板分子，运用单步溶胀聚合法制备了MIPs微球，并分析表明其在识别和厚朴酚分子的过程中存在两类结合位点。袁小红等以柯里拉精为模板、丙烯酰胺为单体，采用本体聚合法合成了对柯里拉精具有高选择性的MIPs[24]。

4.5 其他类 甾体类化合物结构相似，大多含有羟基取代基，可以利用甾体分子和功能单体形成氢键或酯键得到相应的MIPs。Kugimiya等采用共价键法，使油菜素甾酮中的两组顺式羟基和p-2-乙烯基苯硼酸发生酯化反应，制备出植物甾体类油菜素甾酮的MIPs，其对模板分子具有极强、精确的吸附性能，能够防止同样具有顺式羟基的雌激素三醇等成分的干扰。

齐墩果烷属于典型的三萜类化合物，Claude B等以甲基丙烯酸为单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、氯仿为致孔剂，采用热聚合法制备出了齐墩果烷的MIPs[25]。

侯能邦等以香豆素为模板，功能单体选择a-甲基丙烯酸、丙烯酰胺、2-乙烯基吡啶和4-乙烯基吡啶，分别在甲苯、甲醇、氯仿和乙腈中合成出一系列香豆素的MIPs，用于分离富集白芷提取物中的香豆素，取得了良好的效果。Hu S G等用MIP-SPE从秦皮中提取分离出了秦皮乙素，通过选择洗涤和洗脱溶剂，设计了一个秦皮乙素和其结构类似物秦皮甲素、香豆素、7-氧基香豆素和瑞香素的方案。

王亚萍等以香草醛为模板制备出对香草醛具有高度识别性的MIPs，并研究了用不同致孔剂合成的MIPs在水溶液中队香草醛分子的选择性和吸附性[26]。伊春阳等以邻香草醛为模板分子，采用光引发原位聚合法合成了MIPs，并研究证明了其对邻香草醛的优良选择性。

伊艳凤等以大黄素分子为模板，采用原位聚合法制备出一系列分子印迹整体柱，并考察了大黄素分子在不同MIPs上保留因子的变化规律，证明了这些分子印迹整体柱能有效地分离出大黄素及其类似物。翦英红等以香兰素为模板制备出MIPs，通过对其聚合过程和吸附性能进行表征，显示该MIPs对香兰素有较强的吸附性能，能够在竞争分子愈创木酚的混合溶液中选择性分离出香兰素，最大回收率甚至可达89%[27]。Yuan Y等以鬼臼毒素为模板，并优化合成条件，制备的MIPs作为固定相，能够从八角莲、桃儿七和山荷叶中高效分离出鬼臼毒素[28]。

5 小结与展望

分子印迹技术经过几十年的发展，凭借其许多独特的优点，如分子识别性强、固定相制备迅速简单、操作方便、溶剂消耗量少、模板和聚合膜可回收再利用等，在分析、环境、食品、医药卫生等领域都得到广泛应用，在中药研究中的应用也日益普遍。但是，作为一种新型分离技术，MIT还存在许多问题有待解决。首先，分子印迹过程和分子识别过程的机理和表征问题还很模糊，需要从分子水平上真正弄清楚结合位点的作用机理、聚合物的形态和传质机理，使其从目前的定性和半定量描述向完全定量描述发展；其次，目前能得到的功能单体和交联剂种类都很有限，聚合方法也很少，很难满足很多分子的识别要求，以至于限制了分子印迹技术的广泛应用。所以合成新的功能单体和交联剂，探索新的聚合方法和快速去除模板分子的方法是未来的发展方向；此外就是，目前MIPs只能在有机溶剂中聚合和应用，如何能在水溶液或极性溶剂中识别仍比较困难。而且中药中很多活性成分的识别都是在水溶液中进行的，所以将分子印迹和识别从非极性溶剂转向极性溶剂是十分有必要的；最后，现阶段MIT中使用的模板均为小分子的苷元，对于相对分子质量较高的大分子活性成分如蛋白质、糖类以及核酸等的MIPs制备比较困难，所以需要进一步开发更多中药活性成分的模板，将分子印迹研究领域从目前的小分子扩展到大分子领域有重要意义[29]。

尽管分子印迹技术基于上述诸多不完善之处，其在中药研究中的应用受到限制。但是它本身所具备的高度特异性使其逐渐成为中药活性成分的分离纯化不可或缺的手段和研究热点。随着后人研究的深入，相信分子印迹技术的诸多局限性也会逐渐被解决，在中药以及其他各个领域的研究和应用将会更加广泛和深入。

[1]王颖,李楠.分子印迹技术及其应用[J].化工进展,2010,29(12)：2 315-2 323.

[2]马玉哲,李红霞.分子印迹技术的应用进展[J].化工技术与开发，2009,38(4)：20-22,46.

[3]郭秀春,周文辉.分子印迹技术研究进展[J].化学研究，2012，23(5)：1 008-1 011.

[4]张晓旭,游慧珍,李伟,等.分子印迹材料的制备与应用[J].广州化工，2012,40(9)：6-10.

[5]蒲东,胡小玲,管萍,等.乳液聚合法制备双甘氨肽分子印迹聚合物微球[J].过程工程学报，2011,11(4)：671-677.

[6]杨苏宁,丁玉.分子印迹技术的研究进展及其在分离中的应用[J].山西化工，2011,31(4)：31-38.

[7]龚雪云,张磊，缪娟.分子印迹技术在中药有效成分提取分离中的应用研究进展[J].中国药房，2012,23(19)：1 813-1 815.

[8]李利新，李锦，王玉明，等.现代分离技术在中药活性成分快速分离制备研究中的应用[J].中南药学，2012,10(3)：209-212.

[9]韦寿莲，郭小君，汪洪武，等.咖啡因分子印迹固相萃取柱的制备及应用[J].分析化学，2012,40(7)：1 071-1 075.

[10]王靖宇，许振良，张颖.茶碱分子印迹膜色谱的性能[J].膜科学与技术，2010(5)：37-42.

[11]李辉，符再德，石慧，等.沉淀聚合法制备高三尖杉酯碱印迹聚合物[J].化工进展，2009,24(10)：1 787-1 791.

[12]刘韶，李新中，雷鹏，等.甲基莲心碱分子印迹聚合物的制备[J].中南药学，2010,8(8)：575-578.

[13]肖淑娟，李红霞，于守武.分子印迹聚合物的分子识别特性及固相萃取研究[J].化工进展，2010,(2)：293-296.

[14]潘浪胜，刘敏敏，田红锦，等.木犀草素分子印迹聚合物的分子识别特性及固相萃取研究[J].高校化学工程学报，2009,23(2)：360-364.

[15]贺敏强，万金城，孟敏佳，等.山奈酚分子印迹聚合物的制备及其性能表征[J].化学世界，2010,11:670-674.

[16]朱秀芳,贺光艳,成会玲,等.橙皮苷印迹聚合物的识别性能及机理研究[J].化学研究与应用，2009,21(11)：1 516-1 520.

[17]李丽丽，陈小明.芹菜素分子印迹聚合物的合成及谱学研究[J].药学学报，2009,44(8)：868-872.

[18]顾晓红.基于分子印迹分离纯化绿原酸与荧光仿生识别技术研究[D].苏州：苏州大学，2010:53-54.

[19]张华斌，张朝晖，聂燕，等.碳纳米管表面绿原酸印迹固相萃取材料的制备及应用[J].分析化学，2009,37(7)：955-959.

[20]苏立强，梁云凯，张晓林.咖啡酸分子印迹聚合物的制备及其用于咖啡酸的高效液相色谱分离[J].理化检验：化学分册，2010,41(6)：677-679.

[21]Zhu T ,Li S N ,Kyung Ho Row .Molecularly Imprinted Mono-lithie Material for the Extraction of Three Organic Acids from Salicornia herbacea[D].J Appl Polym Sci,2011,121(3):1691-1696.

[22]朱林敏，朱靖博，付绍平，等.丹酚酸A分子印迹聚合物制备及识别性能研究[J].化学研究与应用，2011,23(4):437-443.

[23]洪美花，陈元涛，王婧，等.白藜芦醇分子印迹聚合物微球的制备及特性评价[J].天然产物研究与开发，2010,22(4)：559-563.

[24]王婧，陈元涛，洪美花，等.和厚朴酚分子印迹聚合物微球的制备及表征[J].化学世界，2010,51(10):598-601.

[25]Claude B, Morin P, Lafosse M, et al. Selective solid-phase extraction of a triterpene acid from a plant extract by molecularly imprinted polymer[J].Talanta,2008,75(2):344-350.

[26]王亚萍，李杰，周艳梅，等.分子印迹聚合物的制备及其对香草醛的吸附行为[J].化学研究，2010,21(3)：35-38.

[27]翦英红，范宁伟，赵文生，等.香兰素分子印迹聚合物的制备与表征[J].湘潭大学自然科学学报，2010,32(1)：68-73.

[28]Yuan Y, Wang Y Z, Huang M D, et al. Development and char-acterization of molecularly imprinted polymers for the selective enrichment of podo phyllotoxin from traditional Chinese medichines[J].. Analytica Chimica Acta,2011,695(1-2):63-72.

[29]杨鑫，张华，董爱军，等.分子印迹技术在天然产物分离纯化中的应用[J]..东北农业大学学报，2011,42(8)：146-153.