★ 王大维 梅丽君 温成平

(浙江中医药大学 浙江 杭州 310053)

蛇床子，别名野胡萝卜子，为伞形科植物蛇床子的干燥成熟果实，性温，味苦辛，有小毒。主产于河北、浙江、江苏、四川等地。具有温肾壮阳，祛风燥湿，杀虫之功效。用于阳痿，宫冷，寒湿带下，风湿痹痛等，临床以外用为主。现代医学研究表明，蛇床子素(osthole，OST)具有多种药理作用，例如：抗骨质疏松症，抗高血压，抗心律失常，抗肿瘤，抗衰老，镇痛消炎等。周俊等建立BALB /C 裸鼠的人肺腺癌和肺鳞癌模型，通过观察瘤体的大小、重量和动物血清中肿瘤标志物DR270 的水平评价了蛇床子素的抗癌作用[1]。目前对于其抗癌机理则鲜有报道。本实验以体外培养的Hela细胞为研究对象，观察蛇床子素对Hela细胞的增殖抑制作用，并探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 蛇床子素(西安原生工程技术有限公司，纯度为98%，HPLC检测)；人宫颈癌Hela细胞株为哈尔滨医科大学赠送；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂、RPMI 1640干粉为SIGMA公司产品；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所)；人转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA试剂盒(上海锐谷生物科技有限公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物有限公司)。96孔细胞培养板(丹麦Duke公司); CO2培养箱(德国Heraeus公司)；光学显微镜(日本Olympus);酶联免疫吸附检仪(美国Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的体外培养 Hela细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养夜，置于37℃，CO2体积分数为5%的培养箱中常规培养。取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 实验分为空白组(只加试剂，不含细胞) 、阴性细胞对照组(按常规培养)和实验组。收集对数生长期Hela细胞,接种于96孔细胞培养板中,每孔6000-8000个细胞(100μL)。培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中常规培养24h后,实验组中加入终浓度分别为40；80；120；160；200μg /mL的蛇床子素。每种浓度均设6个平行孔。继续培养24h后每孔加入 5 mg/mL的MTT溶液20μL继续孵育4h, 终止培养,小心吸弃上清,每孔加入二甲基亚砜150μL，摇床上振荡5分钟溶解蓝紫色结晶。用酶标仪于570 nm处读取各孔吸光度值(A570),以空白组A570均值调零，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(% )= (1-实验组A570均值/对照组A570均值)×100%。

1.2.3 光学显微镜观察细胞凋亡形态 将对数期Hela细胞接种于六孔板中，孔内预先放置盖玻片，每孔接种约2×105个细胞，常规培养24h后用药干预。实验组蛇床子素的质量浓度分别为：40；80；110μg /mL。对照组不用药。各设两个复孔，继续培养24h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min,双蒸水清洗,然后进行常规HE染色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封片。倒置显微镜观察，照相。

1.2.4 DNA ladder 法检测细胞凋亡 细胞的培养分组及用药同1.4。蛇床子素干预24h后，PBS清洗，按碧云天试剂盒说明书提取 DNA。取样品于 2%琼脂糖凝胶电泳 , 60V电泳 1 h,凝胶成像图像分析系统照相记录结果。

1.2.5 RT-PCR法检测基因fas和bcl-2的表达 分别收集40;80;110μg /mL三种浓度蛇床子素作用24h后的Hela细胞,用Trizol试剂抽提细胞中总RNA,以随机引物在逆转录酶的作用下合成cDNA,随后进行PCR扩增。同时扩增管家基因β-actin作为内参。PCR反应条件：Fas: 94℃5min预变性；94℃30s, 58℃30s, 72℃1min, 共31个循环；72℃延伸10min。Bcl-2:56℃退火30s，其余同前。各目的基因产物长度如下：β-actin为171bp;fas为242bp;bcl-2为347bp。取PCR产物经2%琼脂糖凝胶进行电泳,采用凝胶成像系统拍照并分析目的基因的相对表达量。

1.2.6 TGF-β1分泌水平的检测 选取对Hela细胞没有显著抑制作用的药物浓度(10μg /mL)干预24h后的培养上清为ost-La；洗去中药后培养24h的上清为ost-Lb；不经药物处理的Hela细胞培养24h的上清作为对照，称为control-L。以定量Elisa法测定各上清中TGF-β1的含量。

2 结果

2.1 蛇床子素对Hela细胞的抑制作用 MTT试验结果显示，在药物浓度为40～200μg /mL的浓度区间内，其抑制作用随着质量浓度的提高而增强。

表1 蛇床子素对Hela细胞增殖的影响

注：与对照组比较，*P﹤0.01。

2.2 光学显微镜下观察细胞形态变化 蛇床子素作用24h后，可观察到细胞形态发生改变。其中40μg /mL剂量组的细胞形态变化不太明显，但细胞已经缩小，胞质浓缩。80μg /mL剂量组细胞变圆并有部分脱落。110μg /mL剂量组可见染色质密集并边缘化，且有凋亡小体出现，见图1。

A.对照组；B.40μg /mL剂量组；C.80μg /mL剂量组；D.110μg /mL剂量组

M: marker C: 对照组 1～3: 40,80,110μg /mL蛇床子素

2.3 DNA Ladder 法检测蛇床子素对Hela细胞凋亡的诱导作用 琼脂糖凝胶电泳可见，对照组细胞只有分子量大的DNA，而110μg /mL剂量组细胞DNA呈典型的梯状条带。80μg /mL剂量组细胞的DNA也可见到梯状条带，而40μg /mL剂量组的则不明显(见图2)。

2.4 RT-PCR方法检测蛇床子素对Hela细胞相关基因的mRNA调控作用 结果见表2 。在未经蛇床子素干预的Hela细胞中Fas表达相对较低，Bcl-2表达相对较高。经不同浓度的蛇床子素干预24h后的Hela细胞中则相反。其中Fas和Bcl-2基因的表达变化呈现明显的浓度依赖性。

表2 蛇床子素对Hela细胞Fas和Bcl-2mRNA水平的影响(相对含量,

注：*P< 0.05 ;**P< 0.01均与0μg/mL剂量组相比。

2.5 蛇床子素对Hela细胞分泌TGF-β1的影响 经和未经药物处理的Hela细胞培养24h所分泌的TGF-β1浓度见表3。

表3 蛇床子素对Hela细胞分泌TGF-β1的影响

注：与control-L相比，*P<0.01 。

3 讨论

蛇床子化学成分复杂，药理作用广泛。目前认为其抗肿瘤的主要活性物质为蛇床子素。本实验采用MTT法检测不同浓度的蛇床子素对Hela细胞的增殖影响，发现蛇床子素也可以使Hela细胞的增殖明显受到抑制，并且在40～200μg/mL内随着浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐升高，表明有浓度依赖关系。MTT检测结果与张宇洁、贺浪冲等[2]人的结果类似，但稍有不同。通过HE染色，光镜下观察发现，蛇床子素处理后Hela细胞形态改变明显，其中蛇床子素为110μg/mL剂量时Hela细胞呈明显的凋亡形态，并通过DNA Ladder实验从生化方面进一步证实了凋亡的发生。

为了探讨蛇床子素对Hela细胞凋亡的影响，本实验测定了经和未经蛇床子素处理的Hela细胞中，Fas和Bcl-2mRNA的表达。结果表明，未经蛇床子素处理的Hela细胞Fas低表达，而Bcl-2高表达。经蛇床子素处理后结果相反，且表达量呈浓度依赖性。Fas和Bcl-2的表达呈负相关。Bcl-2蛋白在许多肿瘤细胞中高表达，在抑制凋亡中起重要作用[3]。Fas基因的产物Fas受体是Ⅰ型跨膜糖蛋白，当Fas与FasL结合后，此结

构域首先与接头蛋白FADD结合，活化的FADD激活Caspase8和Caspase10进而激活一系列的效应因子使细胞发生凋亡[4]。因此认为Fas在蛇床子素诱导的Hela细胞凋亡过程中起到了促进作用，而Bcl-2起到了抑制作用。

TGF-β1能够抑制免疫，对细胞的生长，分化，组织修复具有重要的调节作用[5]。在妇科肿瘤中，TGF-β过度表达可使肿瘤细胞易于逃避机体的免疫监视[6]。其中是促进还是抑制细胞的生长增殖主要取决于细胞类型，也与肿瘤的发展阶段及其他具体条件有关[7]。目前对于TGF-β1与肿瘤凋亡的关系仍不十分清楚。本研究以10μg/mL的蛇床子素为干预因素，测定了未经干预和干预24h后以及干预后洗去蛇床子素再培养24h的培养上清中TGF-β1的含量。结果表明蛇床子素干预后Hela细胞分泌TGF-β1的量显著降低。而洗去蛇床子素再培养的Hela细胞分泌TGF-β1的量极少。提示蛇床子素在抑制Hela细胞增殖的过程中TGF-β1的分泌减少起到一定的作用。

将TGF-β1和Fas联系起来分析：Fas在多种肿瘤的生长和发展过程中是下调的，从而避免T细胞的攻击。我们的实验结果提示蛇床子素有可能通过升高Hela细胞Fas的表达，降低TGF-β1的分泌来降低免疫抑制，但需要体内实验来进一步验证。

综上所述，蛇床子素在诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的同时，可能会使宫颈癌Hela细胞的免疫抑制作用减弱。但是凋亡和肿瘤免疫是一系列复杂的过程，因此需要更广泛和深入的研究。

[1]周俊，程维兴，许永华，等. 蛇床子素对肺腺癌、肺鳞癌生长抑制作用的实验研究[J]. 癌变·畸变·突变,2002,14(4):231-233.

[2]张宇洁，贺浪冲. 用细胞色谱模型筛选长春七抑制Hela细胞增殖的活性成分[J]. 中国药学杂志，2005，40(6)：463-465.

[3]Eberstadt M, Huang B. NMR structure and mutagenesis of the FADD(Mortl) death-effector domain[J]. Nature, 1998,392:941-945.

[4]侯力，吕申，等. 细胞凋亡与肿瘤转移[M]. 国外医学--生理、病理科学与临床分册，2000:20(3):207.

[5]Nicholson DW, Thornberry NA. Caspase : killer proteases[J]. Trends Bichem Sci ,1997 ,22 (8) :299-306.

[6]翟凌，蔡丽瑛，安媛，等. 转化因子β及其Ⅱ型受体在卵巢肿瘤中的表达及临床意义[J]. 中国实用妇科与产科杂志，2005，21(9)：542-544.

[7]Kaminska,B.,A.Wesolowska, M.Danilkiewicz,TGF beta signalling and its role in tumour pathogenesis[J]. Acta Biochim Pol,2005,52(2): 329-37.