陈彦霞+++++刘津麟+++++李涯松

[摘要] 目的 构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Ascl2，并在真核细胞HEK293T细胞中表达，为今后研究Ascl2基因在Tfh细胞的相关分子机制奠定实验基础。方法 PCR方法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因，连接至pIRES2-AcGFP1质粒的多克隆位点中，构建pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒。通过脂质体转染法对HEK293T细胞进行转染。Realtime-PCR及Westernblot方法分析转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2表达情况。结果 经Realtime-PCR及Westernblot方法，证实Ascl2基因能够在HEK293T细胞中正确表达。结论 成功建立表达Ascl2基因的pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒，并能在HEK293T细胞中表达，为进一步研究Ascl2在自身免疫性疾病中Tfh细胞的相关机制奠定了实验基础。

[关键词] Ascl2；HEK293T细胞；Tfh细胞；自身免疫性疾病

[中图分类号] R73-3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）21-0005-03

滤泡辅助性T淋巴细胞（T follicular helper，Tfh）是近年研究发现的CD4+T细胞的新亚群[1]。它的特征性标志为CXCR5+、PD-1+、ICOS+、CCR7-、Bcl-6+。Tfh细胞在机体的生发中心形成和B细胞分化中起重要作用，在对维持机体的免疫平衡发挥重要作用，它的功能失调与自身免疫性疾病及免疫缺陷病中扮演重要角色[2-4]。新近研究发现一种bHLH（basic Helix-Loop-Helix， 碱性螺旋-环-螺旋）转录因子：Ascl2（achaete-scute homologue 2）在Tfh细胞中选择性的表达上调[5]。体外实验中证实异位表达Ascl2能够上调T细胞中的CXCR5的表达，下调CCR7表达，而转录因子Bcl6则不受影响，体内实验则证实异位表达Ascl2可加速T细胞迁移到滤泡及Tfh细胞的发育[5]。然而，Ascl2 在Tfh细胞在表达的具体功能及其调控Tfh细胞的具体分子机制还未完全阐明，本研究旨在建立Ascl2 基因的真核表达载体，将其转染HEK293T细胞并使其表达，为研究Ascl2对Tfh细胞的生物学功能提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 质粒菌株和HEK293细胞

pIRES2-AcGFP1质粒购买于Clontech公司，大肠杆菌DH5α菌株购买于上海生工生物技术服务有限公司。HEK293T细胞购买于中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂

限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ，高保真pfu聚合酶以及T4连接酶为美国Fermentas公司产品；质粒抽提试剂盒为上海生工生物技术服务有限公司产品；高糖DMEM培养基购买于Gibco公司；真核转染试剂 LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；抗人Ascl2及β-actin抗体为Abcam公司产品；辣根过氧化物酶标记的IgG为美国CST公司产品；引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

1.3 HEK293T细胞的培养

HEK293T细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基中，置于37℃，5%CO2孵育箱中贴壁培养，每隔2天用0.25%胰酶消化传代培养。

1.4 重组质粒pIRES2-AcGFP1-Ascl2的构建

1.4.1 Ascl2基因的扩增 取健康人外周血并用淋巴细胞分离液分离单个核细胞并抽提总RNA，在Pubmed上获取Ascl2 基因的CDS序列并设计引物，加入BglⅡ和SalⅠ 酶切位点，用高保真pfu聚合酶扩增Ascl2基因的CDS序列。

1.4.2 重组质粒构建 将PCR反应电泳回收产物和pIRES2-AcGFP1质粒分别由BglⅡ和SalⅠ 限制性内切酶37℃双酶切6 h，进行电泳凝胶回收，取5 μL酶切好的PCR片段及质粒DNA用T4连接酶4℃连接18 h，使Ascl2与pIRES2-AcGFP1质粒连接，将连接产物转化至DH5α感受态细胞在含50μg/mL Kana抗性的LB固体培养基上37℃培养箱中培养过夜，次日挑取单克隆菌落并加入LB液体培养基上摇菌16 h进行大量扩增，提取pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒。

1.5 pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的转染

将5×105HEK293T细胞接种于6孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中温育6 h后使细胞融合度达到70%时，分别用250 μL无血清DMEM高糖培养基液稀释4 μg的质粒或10 μL的 LipofectamineTM2000脂质体溶液，混匀并放置30 min后。将6孔板中培养液吸出，缓慢将混匀液加入6孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中孵育6 h。6 h后弃去转染液，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基继续培养，96 h后收集细胞并提取总RNA及总蛋白。

1.6 检测转染pIRES2-AcGFP-Ascl2的HEK293T细胞中Ascl2的表达

1.6.1 Realtime-PCR检测Ascl2 mRNA表达的检测根据GenBank的人Ascl2 基因序列，设计荧光定量PCR引物并由上海生工生物技术服务有限公司合成。上游引物序列：5′AGCCAACCTGAAAACCCACA3′，下游引物序列：5′GAGTCTGAAGGTGCCGGAAA 3′， 设计并合成内参β-actin引物， 上游引物序列：5′GAATCAATGCAAGTTCGGTTCC 3′， 下游引物序列：5′ TCATCTCCGCTATTAGCTCCG 3′。在转染96 h后提取细胞总RNA并进行real-time PCR。反应条件为95℃10 min，95℃ 15 s及60℃ 55 s共40个循环，各组mRNA同内参β-actin基因相比得到相对表达量并进行统计。endprint

1.6.2 Western blotting检测Ascl2蛋白的表达 转染质粒96 h后的HEK293T细胞，吸去原培养液，PBS洗3次，用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。95℃变性10 min。变性后样本在100 g/L聚丙烯酰胺凝胶上进行分离电泳（200 V，40 min），然后将分离后的蛋白转至硝化纤维膜（60 V，120 min）。将载有蛋白质的纤维膜用0.1% Triton-PBS溶液漂洗3次，10 min/次，并用脱脂奶粉封闭NC膜0.5 h，分别加入Ascl2和β-actin一抗4℃孵育16 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，充分洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的相应种属IgG二抗室温孵育0.5 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，最终漂洗后用ECL显色试剂盒进行显色，在显色后进行曝光。

1.7 统计学处理

采用曼-惠特尼U检验分析HEK293T细胞和HEK293T-Ascl2细胞之间mRNA表达水平的差异，采用SPSS10.0统计软件包进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ascl2基因的提取与鉴定

PCR扩增外周血单个核细胞中Ascl2基因CDS序列后，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，可见581bp的特异条带， 与pubmed上公布的Ascl2基因的CDS序列大小一致（图1）。

图1 PCR方法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因

（A：DNA分子量标准；B：PCR产物）

2.2 Ascl2基因真核表达载体的构建

将PCR扩增出的581bp的基因片段与空载体 pIRES2-AcGFP1连接成功后，用BglⅡ和SalⅠ双酶切鉴定（图 2），并送测序，结果用 BLAST软件进行分析，与 Pubmed中GenBank公布的序列一致。

图 2 重组质粒 pIRES2-AcGFP1-Ascl2的酶切鉴定

（A：DNA 分子量标准； B： pIRES2-AcGFP1-Ascl2/BglII+SalI）

2.3 转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2的mRNA及蛋白水平的检测

2.3.1 Real Time PCR检测Ascl2的mRNA结果 HEK293T-Ascl2细胞组Ascl2的mRNA表达量明显高于人HEK293T细胞组，差异有统计学意义（P=0.0235）（图3）。

图3 Real Time PCR检测转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2的mRNA表达水平

2.3.2 Western blotting检测Ascl2蛋白表达 在约28kDa（Ascl2）、42kDa（β-actin）处见到特异性条带，Ascl2-HEK293T组条带颜色相比HEK293T组颜色明显加深（图4），表明重组pIRES2-AcGFP1-Ascl2质粒能在HEK293T细胞中正确表达及翻译（图4）。

图4 Western blotting检测转染pIRES2-AcGFP-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2蛋白的表达情况

3 讨论

Tfh细胞是表达Ascl2的新型CD4+效应性T细胞亚群，其特征是能够迁移并定位于淋巴滤泡、产生IL-21等细胞因子、表达ICOS等共刺激分子，从而最终辅助B细胞发挥体液免疫的功能[6-9]。但关于Tfh细胞的研究仍有许多重要问题有待进一步深入探讨，如Ascl2在机体发生自身免疫性疾病时，转录因子Ascl2是怎样参与Tfh细胞的发生发展的，是否可以通过有效抑制Tfh细胞的Ascl2 转录因子的表达来治疗自身免疫性疾病等，随着研究的不断深入，Tfh细胞中的关键转录分子以及表面分子等将成为治疗临床自身免疫性疾病的关键靶点[2，10]。

为此，在本研究中我们通过慢病毒pIRES2-AcGFP1穿梭载体，将Ascl2和绿色荧光AcGFP1基因构建在一起，这将有利于对Tfh细胞中转录因子Ascl2进行定位和示踪。另外，通过pIRES2-AcGFP1穿梭载体的内部核糖体进入位点序列（IRES），达到GFP基因和Ascl2 的分别表达，从而排除了AcGFP1荧光蛋白对Ascl2 蛋白功能的影响，从而为下一步研究Ascl2分子在Tfh细胞介导的自身免疫性疾病中的作用及具体信号通路建立了实验基础，将有助于进一步阐明自身免疫性疾病中Ascl2 分子通过何种机制促进Tfh细胞大量产生从而进一步辅助B细胞产生大量的自身抗体，从而对临床系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎以及溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病的发病机制进一步了解。

[参考文献]

[1] Ma CS，Deenick EK. Human T follicular helper （Tfh） cells and disease[J]. Immunol Cell Biol，2014，92（1）：64-71.

[2] Craft JE. Follicular helper T cells in immunity and systemic autoimmunity[J]. Nat Rev Rheumatol，2012，8（6）：337-347.

[3] Zhang X，Ing S，Fraser A，et al. Follicular helper T cells： new insights into mechanisms of autoimmune diseases[J]. Ochsner J，2013，13（1）：131-139.

[4] Liu X，Yan X，Zhong B，et al. Bcl6 expression specifies the T follicular helper cell program in vivo[J]. J Exp Med，2012，209（10）：1841-1852，S1841-1824.

[5] Liu X，Chen X，Zhong B，et al. Transcription factor achaete-scute homologue 2 initiates follicular T-helper-cell development[J]. Nature，2014，507（7493）：513-518.

[6] Yang X， Yang J， Chu Y， et al. T follicular helper cells mediate expansion of regulatory B cells via IL-21 in Lupus-prone MRL/lpr mice[J]. PLoS One， 2013，8（4）：e62855.

[7] King C，Tangye SG，Mackay CR. T follicular helper （TFH） cells in normal and dysregulated immune responses[J]. Annu Rev Immunol，2008，26：741-766.

[8] Shekhar S，Yang X. The darker side of follicular helper T cells： from autoimmunity to immunodeficiency[J]. Cell Mol Immunol，2012，9（5）：380-385.

[9] Xu H，Li X，Liu D，et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility[J]. Nature，2013，496（7446）：523-527.

[10] Liu X，Nurieva RI，Dong C. Transcriptional regulation of follicular T-helper（Tfh） cells[J]. Immunol Rev，2013， 252（1）：139-145.

（收稿日期：2014-04-22）endprint

1.6.2 Western blotting检测Ascl2蛋白的表达 转染质粒96 h后的HEK293T细胞，吸去原培养液，PBS洗3次，用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。95℃变性10 min。变性后样本在100 g/L聚丙烯酰胺凝胶上进行分离电泳（200 V，40 min），然后将分离后的蛋白转至硝化纤维膜（60 V，120 min）。将载有蛋白质的纤维膜用0.1% Triton-PBS溶液漂洗3次，10 min/次，并用脱脂奶粉封闭NC膜0.5 h，分别加入Ascl2和β-actin一抗4℃孵育16 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，充分洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的相应种属IgG二抗室温孵育0.5 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，最终漂洗后用ECL显色试剂盒进行显色，在显色后进行曝光。

1.7 统计学处理

采用曼-惠特尼U检验分析HEK293T细胞和HEK293T-Ascl2细胞之间mRNA表达水平的差异，采用SPSS10.0统计软件包进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ascl2基因的提取与鉴定

PCR扩增外周血单个核细胞中Ascl2基因CDS序列后，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，可见581bp的特异条带， 与pubmed上公布的Ascl2基因的CDS序列大小一致（图1）。

图1 PCR方法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因

（A：DNA分子量标准；B：PCR产物）

2.2 Ascl2基因真核表达载体的构建

将PCR扩增出的581bp的基因片段与空载体 pIRES2-AcGFP1连接成功后，用BglⅡ和SalⅠ双酶切鉴定（图 2），并送测序，结果用 BLAST软件进行分析，与 Pubmed中GenBank公布的序列一致。

图 2 重组质粒 pIRES2-AcGFP1-Ascl2的酶切鉴定

（A：DNA 分子量标准； B： pIRES2-AcGFP1-Ascl2/BglII+SalI）

2.3 转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2的mRNA及蛋白水平的检测

2.3.1 Real Time PCR检测Ascl2的mRNA结果 HEK293T-Ascl2细胞组Ascl2的mRNA表达量明显高于人HEK293T细胞组，差异有统计学意义（P=0.0235）（图3）。

图3 Real Time PCR检测转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2的mRNA表达水平

2.3.2 Western blotting检测Ascl2蛋白表达 在约28kDa（Ascl2）、42kDa（β-actin）处见到特异性条带，Ascl2-HEK293T组条带颜色相比HEK293T组颜色明显加深（图4），表明重组pIRES2-AcGFP1-Ascl2质粒能在HEK293T细胞中正确表达及翻译（图4）。

图4 Western blotting检测转染pIRES2-AcGFP-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2蛋白的表达情况

3 讨论

Tfh细胞是表达Ascl2的新型CD4+效应性T细胞亚群，其特征是能够迁移并定位于淋巴滤泡、产生IL-21等细胞因子、表达ICOS等共刺激分子，从而最终辅助B细胞发挥体液免疫的功能[6-9]。但关于Tfh细胞的研究仍有许多重要问题有待进一步深入探讨，如Ascl2在机体发生自身免疫性疾病时，转录因子Ascl2是怎样参与Tfh细胞的发生发展的，是否可以通过有效抑制Tfh细胞的Ascl2 转录因子的表达来治疗自身免疫性疾病等，随着研究的不断深入，Tfh细胞中的关键转录分子以及表面分子等将成为治疗临床自身免疫性疾病的关键靶点[2，10]。

为此，在本研究中我们通过慢病毒pIRES2-AcGFP1穿梭载体，将Ascl2和绿色荧光AcGFP1基因构建在一起，这将有利于对Tfh细胞中转录因子Ascl2进行定位和示踪。另外，通过pIRES2-AcGFP1穿梭载体的内部核糖体进入位点序列（IRES），达到GFP基因和Ascl2 的分别表达，从而排除了AcGFP1荧光蛋白对Ascl2 蛋白功能的影响，从而为下一步研究Ascl2分子在Tfh细胞介导的自身免疫性疾病中的作用及具体信号通路建立了实验基础，将有助于进一步阐明自身免疫性疾病中Ascl2 分子通过何种机制促进Tfh细胞大量产生从而进一步辅助B细胞产生大量的自身抗体，从而对临床系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎以及溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病的发病机制进一步了解。

[参考文献]

[1] Ma CS，Deenick EK. Human T follicular helper （Tfh） cells and disease[J]. Immunol Cell Biol，2014，92（1）：64-71.

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[3] Zhang X，Ing S，Fraser A，et al. Follicular helper T cells： new insights into mechanisms of autoimmune diseases[J]. Ochsner J，2013，13（1）：131-139.

[4] Liu X，Yan X，Zhong B，et al. Bcl6 expression specifies the T follicular helper cell program in vivo[J]. J Exp Med，2012，209（10）：1841-1852，S1841-1824.

[5] Liu X，Chen X，Zhong B，et al. Transcription factor achaete-scute homologue 2 initiates follicular T-helper-cell development[J]. Nature，2014，507（7493）：513-518.

[6] Yang X， Yang J， Chu Y， et al. T follicular helper cells mediate expansion of regulatory B cells via IL-21 in Lupus-prone MRL/lpr mice[J]. PLoS One， 2013，8（4）：e62855.

[7] King C，Tangye SG，Mackay CR. T follicular helper （TFH） cells in normal and dysregulated immune responses[J]. Annu Rev Immunol，2008，26：741-766.

[8] Shekhar S，Yang X. The darker side of follicular helper T cells： from autoimmunity to immunodeficiency[J]. Cell Mol Immunol，2012，9（5）：380-385.

[9] Xu H，Li X，Liu D，et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility[J]. Nature，2013，496（7446）：523-527.

[10] Liu X，Nurieva RI，Dong C. Transcriptional regulation of follicular T-helper（Tfh） cells[J]. Immunol Rev，2013， 252（1）：139-145.

（收稿日期：2014-04-22）endprint

1.6.2 Western blotting检测Ascl2蛋白的表达 转染质粒96 h后的HEK293T细胞，吸去原培养液，PBS洗3次，用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。95℃变性10 min。变性后样本在100 g/L聚丙烯酰胺凝胶上进行分离电泳（200 V，40 min），然后将分离后的蛋白转至硝化纤维膜（60 V，120 min）。将载有蛋白质的纤维膜用0.1% Triton-PBS溶液漂洗3次，10 min/次，并用脱脂奶粉封闭NC膜0.5 h，分别加入Ascl2和β-actin一抗4℃孵育16 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，充分洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的相应种属IgG二抗室温孵育0.5 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，最终漂洗后用ECL显色试剂盒进行显色，在显色后进行曝光。

1.7 统计学处理

采用曼-惠特尼U检验分析HEK293T细胞和HEK293T-Ascl2细胞之间mRNA表达水平的差异，采用SPSS10.0统计软件包进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ascl2基因的提取与鉴定

PCR扩增外周血单个核细胞中Ascl2基因CDS序列后，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，可见581bp的特异条带， 与pubmed上公布的Ascl2基因的CDS序列大小一致（图1）。

图1 PCR方法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因

（A：DNA分子量标准；B：PCR产物）

2.2 Ascl2基因真核表达载体的构建

将PCR扩增出的581bp的基因片段与空载体 pIRES2-AcGFP1连接成功后，用BglⅡ和SalⅠ双酶切鉴定（图 2），并送测序，结果用 BLAST软件进行分析，与 Pubmed中GenBank公布的序列一致。

图 2 重组质粒 pIRES2-AcGFP1-Ascl2的酶切鉴定

（A：DNA 分子量标准； B： pIRES2-AcGFP1-Ascl2/BglII+SalI）

2.3 转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2的mRNA及蛋白水平的检测

2.3.1 Real Time PCR检测Ascl2的mRNA结果 HEK293T-Ascl2细胞组Ascl2的mRNA表达量明显高于人HEK293T细胞组，差异有统计学意义（P=0.0235）（图3）。

图3 Real Time PCR检测转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2的mRNA表达水平

2.3.2 Western blotting检测Ascl2蛋白表达 在约28kDa（Ascl2）、42kDa（β-actin）处见到特异性条带，Ascl2-HEK293T组条带颜色相比HEK293T组颜色明显加深（图4），表明重组pIRES2-AcGFP1-Ascl2质粒能在HEK293T细胞中正确表达及翻译（图4）。

图4 Western blotting检测转染pIRES2-AcGFP-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2蛋白的表达情况

3 讨论

Tfh细胞是表达Ascl2的新型CD4+效应性T细胞亚群，其特征是能够迁移并定位于淋巴滤泡、产生IL-21等细胞因子、表达ICOS等共刺激分子，从而最终辅助B细胞发挥体液免疫的功能[6-9]。但关于Tfh细胞的研究仍有许多重要问题有待进一步深入探讨，如Ascl2在机体发生自身免疫性疾病时，转录因子Ascl2是怎样参与Tfh细胞的发生发展的，是否可以通过有效抑制Tfh细胞的Ascl2 转录因子的表达来治疗自身免疫性疾病等，随着研究的不断深入，Tfh细胞中的关键转录分子以及表面分子等将成为治疗临床自身免疫性疾病的关键靶点[2，10]。

为此，在本研究中我们通过慢病毒pIRES2-AcGFP1穿梭载体，将Ascl2和绿色荧光AcGFP1基因构建在一起，这将有利于对Tfh细胞中转录因子Ascl2进行定位和示踪。另外，通过pIRES2-AcGFP1穿梭载体的内部核糖体进入位点序列（IRES），达到GFP基因和Ascl2 的分别表达，从而排除了AcGFP1荧光蛋白对Ascl2 蛋白功能的影响，从而为下一步研究Ascl2分子在Tfh细胞介导的自身免疫性疾病中的作用及具体信号通路建立了实验基础，将有助于进一步阐明自身免疫性疾病中Ascl2 分子通过何种机制促进Tfh细胞大量产生从而进一步辅助B细胞产生大量的自身抗体，从而对临床系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎以及溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病的发病机制进一步了解。

[参考文献]

[1] Ma CS，Deenick EK. Human T follicular helper （Tfh） cells and disease[J]. Immunol Cell Biol，2014，92（1）：64-71.

[2] Craft JE. Follicular helper T cells in immunity and systemic autoimmunity[J]. Nat Rev Rheumatol，2012，8（6）：337-347.

[3] Zhang X，Ing S，Fraser A，et al. Follicular helper T cells： new insights into mechanisms of autoimmune diseases[J]. Ochsner J，2013，13（1）：131-139.

[4] Liu X，Yan X，Zhong B，et al. Bcl6 expression specifies the T follicular helper cell program in vivo[J]. J Exp Med，2012，209（10）：1841-1852，S1841-1824.

[5] Liu X，Chen X，Zhong B，et al. Transcription factor achaete-scute homologue 2 initiates follicular T-helper-cell development[J]. Nature，2014，507（7493）：513-518.

[6] Yang X， Yang J， Chu Y， et al. T follicular helper cells mediate expansion of regulatory B cells via IL-21 in Lupus-prone MRL/lpr mice[J]. PLoS One， 2013，8（4）：e62855.

[7] King C，Tangye SG，Mackay CR. T follicular helper （TFH） cells in normal and dysregulated immune responses[J]. Annu Rev Immunol，2008，26：741-766.

[8] Shekhar S，Yang X. The darker side of follicular helper T cells： from autoimmunity to immunodeficiency[J]. Cell Mol Immunol，2012，9（5）：380-385.

[9] Xu H，Li X，Liu D，et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility[J]. Nature，2013，496（7446）：523-527.

[10] Liu X，Nurieva RI，Dong C. Transcriptional regulation of follicular T-helper（Tfh） cells[J]. Immunol Rev，2013， 252（1）：139-145.

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