赵艳争

(天津市北辰医院检验科 天津北辰 300400)

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是由Dane颗粒的外壳和直径22nm的球型颗粒和管型颗粒所组成。HBsAg是人体感染乙型肝炎病毒(HBV)的标志，是人体感染HBV后最先出现的指标，具有免疫原性，可激发机体产生相应的抗体。目前，中国大多数实验室采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法及胶体金法进行检测。但对于HBsAg低浓度的标本，检测时常因方法学的原因造成灵敏度较低，导致临床出现漏检，并且由于其检测的影响因素较大，尤其是对灰区附近的标本测定结果差异更大，导致重复性差。胶体金法虽然操作简单，但灵敏度最低，临床漏检率最高。光激化学发光免疫分析法(LICA)始于20世纪90年代问世的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术LOCI经过长时间的发展国内已成功研制了基于LOCI检测原理的LICA及检测设备和相关试剂。本文使用LICA、ELISA及胶体金法同时测定经电化学发光免疫分析法ECLIA筛选的HBV定量检测阳性胶体金法标本吸光度与仪器所给临界值 Cut－off的比值 COI为1－50的临床标本60例，HBsAgCOI＜1的临床标本30例作为阴性对照，以天津市临床检验中心提供的临界值控制品作为质控，结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 临床标本经HBV DNA定量聚合酶链反应(PCR)检测阳性且经ECLIA筛选如下模式:HBsAg COI在1～50的临床标本60例(观察组)，30份正常人血清来自本院体检中心(对照组)。以天津市临床检验中心提供的临界值控制品作为质控。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂。LICAHT高通量免疫分析仪METTLE全自动移液器以及试剂盒;西化仪(北京)科技有限公司电化学发光分析仪及配套试剂;上海蓝基生物科技有限公司 ELISAHBSAg试剂盒;南京普朗 9602A酶标仪;普朗 DNX－9620洗板机;上海金标生物胶体金法试剂。

1.2.2 测定方法。①LICA测定HBsAg的含量采用双抗体夹心法。基础原理是一种均相免疫反应，均相条件下将试剂1(R1内部带有染料的纳米感光微粒，试剂2(R2内部带有发光化合物包被有活性分子的纳米发光微粒与待测样本进行混合。此时R1中的感光微粒和R2中的发光微粒可快速有效地捕捉待测物质形成免疫复合物。复合物经过680nm激发光照射后感光微粒中的染料被诱导激活并释放出高能态的单线态氧，而单线态氧能被近距离200nm的发光微粒所俘获，发光微粒进而释放出高能级的红光610nm通过单光子计数器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。当样本不含待测物质时，2种微粒间则无法形成免疫复合物单线态氧在液相中迅速衰减无法传递至发光微粒表面检测时则无光子产生。②ECLIA测定HBsAg的含量采用双抗体夹心法:生物素标志的抗－HBs，三联吡啶钉络合物[Ru(bpy)3]2+标志的抗－HBs与待测样品共同孵育，形成[Ru(bpy)3]2+/2HBsAg/2抗－HBS/2HBsAg生物素的复合体，再和亲和素标记的磁微粒孵育，形成[Ru(hpy)3]2+/2HBsAg/2抗－HBS/2HBsAg生物素2亲和素磁微粒复合体，接着蠕动泵将反应液吸入流动室，磁微粒由磁铁吸附到电极表面，加入三丙胺(TPA)，电极加电压，启动EcL反应，有光电倍增管测量光的强度，光的强度与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系，从而可得出样品中HBsAg的含量。③ELISA法。用ELISA法测HBsAg，严格按上海蓝基生物科技有限公司提供的说明书进行。④胶体金法。严格按上海金标生物提供的说明书进行。

2 结果

2.1 4种方法灵敏度实验比较 取天津市临床检验中心临界值血清进行不同浓度稀释，采用LICA法、ECLIA法、ELISA法及胶体金法分别重复测定5次，结果如下:HBSAg浓度为0.10ng/mL时ECLIA为阳性 (COI＞1);HBSAg浓度为0.25ng/mL时LICA为阳性(LICA＞0.2ng/mL);HBSAg浓度为0.50ng/mL时ELISA为阳性(OD/CO＞2.1);HBSAg浓度为1.00ng/mL时胶体金法为阳性(试纸条出现2条红色带)。见表1。

表1 4种方法测定HBsAg的灵敏度比较(ng/mL)

2.2 4种方法测定HBsAg结果比较 4种方法检测两组样本，以ECLIA法作比较，其中LICA检出率为98.33%，ELISA法检出率为93.33%，胶体金法检出率仅为26.67%，见表2。

表2 4种方法HBsAg测定结果比较

3 讨论

HBsAg是检测HBV首选的免疫学标志物，胶体金法和ELISA两步法检测HBsAg在国内已被广泛采用。ELISA灵敏度较低＜0.5ng/mL而出现漏检，而且ELISA方法需要反复加样和洗板，引入的误差加大。加上酶标板的孔间存在差异等问题一直导致该法精密度较差。胶体金法虽然操作简单方便，但由于其方法学的原因灵敏度更低，同样对低浓度HBsAg检测会产生假阴性结果[1]。

而ECLIA是近年来继荧光免疫法FIA，放射免疫法RIA和酶联免疫法EIA之后发展起来的新兴免疫标记技术。该技术使用的标记物稳定，无放射性污染，已发展成为国外检测病毒性肝炎血清学指标的重要方法。ECLIA试剂的优势在于其不仅具有较高的灵敏度，而且还具有更宽的线性范围。但是该方法所需仪器和试剂成本较高[2]，不适宜在基层地方推广。

LICA技术使用了纳米级颗粒，增加了生物分子的包被面积，同时借助链霉亲和素－生物素放大系统极大地提高了检测灵敏度，减少样本和试剂的用量。它避免了传统检测方法中繁琐的分离和洗涤步骤有效降低了检测背景值减少了反应时间并可实现自动化操作[3]。目前国内已经研制了与该方法配套的检测病毒性肝炎标志物和相关肿瘤标志物的全自动检测系统。本文使用LICA对HBsAg的检测结果显示LICA对HBsAg的分析灵敏度可达到0.25ng/mL，60例阳性样本中仅1例未检出与ECLIA测定结果最为相近。而ELISA与胶体金法的漏检率为6.67%和73.33%，对低浓度样品易漏检且无法得知被测物真正的浓度.给临床诊断和治疗带来许多不便，而LICA和ECLIA均可对HBsAg进行定量。本实验中LICA和ECLIA检出相符性均很高(98.89%)而且LICA已经实现了仪器和试剂的国产化，成本较低，可以有效降低医疗费用。与ECLIA相比LICA具备相近的检测性能，但可控制成本。与ELISA及胶体金法比较LICA具有更高的敏感度并可简化操作步骤，使实验更快捷且该法可进行自动化定量检测，可动态观察疗效和监测病情，适于临床使用[4]。

[1] 吕学琴，马雅静.电化学发光免疫分析法与酶联免疫吸附、胶体金测定低浓度HBsAg的效果评价[J].国际检验医学杂志，2013，34(9):1133

[2] 周迎春，陈 辉，关 平，等.3种方法测定低浓度乙型肝炎病毒表面抗原效果评价[J].检验医学与临床，2007，4(11):1070

[3] SzekeresPG，LeongK，DayTA，et al.Developmentof homogeneous384 －wellhigh－throughputscreeningassays forAbeta1－40andAbeta1－42usingalphascreentechnology J[J].JBiomolScreen，2008，13(2):101

[4] 陈桂兰，陆 燕.光激化学发光免疫分析法测定低浓度HBsAg效果评价[J].重庆医学，2012，41(25):2652