，，

(浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014)

双酚A(BPA)是一种重要的化工原料，主要被用来合成聚碳酸酯(PC)和环氧树脂等材料，在日常生活中得到广泛运用，如婴儿用的奶瓶，食品包装，牙科填充剂等[1-2].BPA生产过程中的泄漏、含BPA的物品不合理处置等途径都使得BPA很容易进入到土壤、水体和大气中，环境中BPA污染问题广泛存在[3-4].BPA能导致内分泌失调，威胁着胎儿和儿童的健康，癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与此有关.此外，BPA是一种重要的内分泌干扰物，具有雌激素活性[5]，BPA在环境中的暴露对人类健康和其他生物产生了严重的危害[6-7].因此，寻求一种合适的方法减缓或者消除环境中BPA污染显得十分重要.相比其他污染修复方法，微生物修复技术具有成本低、二次污染小等优点，利用微生物降解BPA的研究已经成为热点.HAYATO YAMANAKA等[8]筛选出三株短小芽胞杆菌属细菌，分别命名为BP-2CK，BP-21DK和BP-22DK.这三株菌株在含有营养物质的培养基里可分别降解质量浓度为25，25，50 mg/L的BPA.邓伟光等[9]分离出一株BPA降解菌，当BPA的质量浓度为10 mg/L时，BPA的去除率达到最大值44.7%.Ko-ichi Oshiman等[10]分离得到的SphingomonasbisphenolicumAO1可以在48 h内降解质量浓度100 mg/L的BPA，但是，降解液里须加入1%的葡萄糖.真菌同样具有对BPA的降解能力[11-12]：A. Omoike等[11]研究发现真菌Heliscuslugdunensis在12 d的时间内对质量浓度为10 mg/L的BPA的降解率为70%.本实验分离筛选得到一个未被报道过的菌属，该菌株具有高效的BPA降解能力且不需要严格的降解条件，值得对其进行更深一步的研究，所有的研究成果将对环境中BPA污染的微生物修复提供好的基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BPA(纯度为99%)，相关抗生素和甲醇(色谱纯)均购自阿拉丁，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

无机盐培养基(g/L)：NaCl 1，K2HPO41.5，KH2PO40.5，(NH4)2SO41.5，MgSO40.1，溶剂为去离子水，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121 ℃，20 min)后制得.

无机盐固体培养基：基础盐培养基中加入1.5%的琼脂粉，高压蒸汽灭菌(121 ℃，20 min)后制得.

LB 液体培养基(g/L)：酵母粉10.0，蛋白胨5.0，氯化钠10.0，溶剂为去离子水，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121 ℃，20 min)后制得.

LB 固体培养基：LB液体培养基加入1.5%的琼脂粉，高压蒸汽灭菌(121 ℃，20 min)后制得.

微量元素溶液(g/L)：MnSO4·H2O 0.13，ZnCl20.23，CuSO4·H2O 0.03，CoCl2·6H2O 0.42，Na2MoO4·2H2O 0.15，AlCl3·6H2O 0.05，溶剂为去离子水，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121 ℃，20 min)后制得.

1.2 试验方法

1.2.1 BPA降解菌的驯化、分离与纯化

称取5 g活性污泥样品置于100 mL无机盐培养基中(BPA质量浓度为20 mg/L)，有氧振荡培养(30 ℃，150 r/min)1周，取5 mL上层浊液于新鲜的无机盐培养基中(BPA质量浓度40 mg/L)，继续有氧振荡培养(30 ℃，150 r/min)1周，重复上述操作过程6次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液，新的培养基中的BPA质量浓度以20 mg/L的梯度递增.

对最后一次培养所得的培养液5 mL进行梯度稀释，稀释倍数分别为10-3，10-4，10-5，10-6，取各个稀释后的培养液100 μL涂布于含BPA的LB固体培养基(BPA质量浓度100 mg/L)上，30 ℃有氧恒温培养，待菌落长到合适大小，利用显微镜观察选择、挑取不同菌落，通过划线技术在LB固体培养基(BPA质量浓度100 mg/L)上反复纯化，直至菌落单一.把菌落单一的细菌分别接种至LB液体培养基中，30 ℃，150 r/min培养条件下过夜培养，将培养好的菌液离心(6 000 r/min，5 min)后接至无机盐培养基中(BPA质量浓度为50 mg/L)30 ℃有氧培养3 d，通过高效液相色谱法(HPLC)检测各富集培养液中BPA的残留量，最后筛选获得一株能高效降解BPA的菌株Shinellasp. HZB1.

1.2.2 菌种的鉴定

结合细菌生理生化、形态及16S rDNA序列系统发育分析对菌种进行鉴定.菌株形态及生理生化特性测定参照文献[14]进行.16S rDNA扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(正向)，5′-CGGCTACCTTGTTACGACTTC-3′(反向).PCR产物导入大肠杆菌宿主，扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序.将测序结果与GenBank中相关16S rDNA序列进行BLAST比对，用Neighbor-Joining法构建系统发育树.

1.2.3 降解条件优化

响应面法(Response surface methodology, RSM)是近几年发展起来的一种分析方法，可以对实验几种因素或者条件进行优化，找出最佳条件[15].实验在考察了培养温度、摇床转数、pH值和初始接种量的单因素实验结果的基础上，选取三个主要因素进行降解条件的优化，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，选取培养温度、pH值和初始接种量三个反应条件为自变量，以BPA降解率(%)为响应值.分析软件为Design-Expert software(version 8.0.5b)，因素和水平取值见表1.

表1 试验因素水平及编码

1.2.4 BPA降解实验

BPA降解、细菌生长实验：将培养24 h的菌液离心，取湿重为0.2 g的菌体接种到100 mL无机盐培养基(BPA质量浓度100 mg/L)中，在最适条件下振荡培养；未接种菌体的无机盐培养(BPA质量浓度100 mg/L)在最适条件下振荡培养，作为对照实验.连续测定BPA的降解情况，同时测定细胞的生长情况.所有的实验过程均重复三次.

不同BPA初始浓度的降解情况：将培养24 h的菌液离心，取湿重为0.2 g的菌体接种到100 mL(BPA质量浓度分别为50，100，150，200，300 mg/L)的无机盐培养基中，最适条件下培养，每2 h测定BPA的降解情况，所有的实验过程均重复三次.

1.3 检测方法

BPA降解情况的检测：实验采用高效液相色谱法(HPLC)检测培养液里BPA的残留量.降解液在12 000 r/min条件下离心20 min，过孔径为0 45 μm的膜，于4 ℃保存备用.HPLC检测条件：流动相为V(CH3OH)∶V(H2O)=80∶20，分析柱为Grace Alltima C18 Column(4.6 mm×250 mm,5 μm)，检测波长279 nm，柱温30 ℃，流速0.8 mL/min，进样量20 μL.

细菌生长量的检测：用紫外可见分光光度计(JASCO V-550型)测定细菌生长量.细菌培养液经过离心(12 000 r/min，20 min，4 ℃)获得菌体，用等

体积的生理盐水洗涤3次，然后用等体积的生理盐水重新悬浮，在600 nm处测定其OD值.

2 结果与讨论

2.1 菌种的鉴定

经过一系列驯化、富集筛选过程，有5株不同的菌株在含BPA无机盐固体培养基中生长良好，分别对它们的BPA降解能力进行验证，发现其中一株具有明显的高效降解BPA的能力，选择这株细菌保存，用于更进一步研究.该菌株为革兰氏阴性，好氧，有鞭毛，运动型细菌，大小(0.5～1.0)×(1.5～2.0) μm(图1).在LB固体培养基上生长4 d后，菌落呈淡黄色，湿润，圆形，隆起，表面光滑，边缘整齐，不透明.能利用淀粉、对硝基苯酚、酵母膏、吐温40、葡萄糖、作为惟一碳源生长.甲基红试验阴性，过氧化氢酶阳性，氧化酶阳性.该菌抗氨苄青霉素、链霉素、氯霉素和卡那霉素，对庆大霉素敏感.根据16S rDNA序列构建系统发育树，如图2所示，通过序列同源性分析，确定该菌株属于申氏杆菌属.

图1 菌株HZB1的透射电镜图

图2 菌株HZB1的系统发育树

2.2 降解条件优化

独立变量的实验设计和响应值见表2，利用Design Expert 8.0.5b软件进行多元回归设计及分析，得出二次多项回归方程为

Y=97.83+2.82X1+2.12X2+0.17X3-

5.23X12-4.08X22-2.28X32

其中：Y为BPA预测降解率；X1为温度；X2为pH；X3为接种量.

表2 Box-Behnken实验设计和BPA降解响应值

模型的显著系数p=0.005 7(p<0.01)，该模型具有高度的显著性，可靠性极高.温度和pH对BPA降解率影响显著系数分别为0.003 1，0.010 1，对降解率的影响显著，菌体接种量的影响不显著(p=0.754 1).当接种量为0.2 g/L时，最佳的降解条件为度32.7 ℃，pH 7.5，预测降解率达98.45%.为验证该模型预测的准确性，按照上述条件进行实验，得出的实际降解率为98.10%，与预测值十分接近，表示该模型能很好地预测实际表达情况.

图3 HZB1接种量为0.2 g/L的响应面图

2.3 菌株HZB1的生长和对BPA的降解曲线

取湿重为0.2 g的菌体接种到100 mL无机盐培养基(BPA质量浓度100 mg/L)中，每两个小时测定菌株的细胞浓度和BPA的残留.结果如图4所示，经过12 h培养，97.5%的BPA被降解，未加细菌的空白对照的BPA质量浓度(100 mg/L)基本未变化，这说明了菌株HZB1对BPA具有很强的降解能力.菌细胞浓度先有所降低，待菌体适应了培养基环境后，细菌迅速生长，最大生长浓度OD600达到0.23，说明该菌株可以以BPA为惟一碳源生长.

图4 BPA降解和菌株HZB1生长曲线

2.4 BPA初始浓度对降解的影响

不同BPA初始浓度对其降解的影响见图5.当BPA质量浓度小于150 mg/L时，BPA几乎被完全降解，说明该菌株对低质量浓度的BPA具有很好的降解效果.当BPA的质量浓度达到200 mg/L时，77%的BPA被降解，质量浓度为300 mg/L时降解率达到了42%，该菌株对BPA耐受质量浓度比已报道的均高，菌株HZB1对高浓度的BPA污染也有很好的去除作用.

图5 菌株HZB1对不同浓度BPA的降解率

3 结 论

从杭州市某污水处理厂活性污泥中筛选得到了1株BPA高效降解菌.经过形态学观察、生理生化特性研究和16S rRNA的序列分析，该菌确定为申氏杆菌属，属于未曾报道过有BPA降解能力的菌属.菌株对低质量浓度的BPA有很好的降解效果，初始质量浓度为100 mg/L的BPA，12 h的降解率达到97.5%.该菌株对BPA的最大耐受质量浓度达到300 mg/L.该菌属对BPA降解能力和高质量浓度的BPA的耐受能力比已有文献报道均强.此外，利用响应面法优化了该菌的降解条件，在细菌接种量为0.2 g/L时，温度32.7 ℃，pH值在7.5为最佳降解条件，最大预测降解率为98.45%，这和实际实验结果较为符合.本实验所得到的数据为BPA污染微生物修复提供了理论基础.

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