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(浙江工业大学 机械工程学院，浙江 杭州 310014)

我国的农药以有机磷和氨基甲酸酯类农药为主，而酶抑制法是我国农药残留速测的主流技术.由于电化学生物传感器具有高的选择性和灵敏度，能快速响应，并且操作简单，适合农药的现场检测，因此，乙酰胆碱酯酶(AChE)电化学传感器的研究受到了广泛重视[1-2].传统的玻碳电极存在导电性差、表面难以功能化修饰和比表面积低等缺点，使得电化学生物传感器对生物分子的检测灵敏度低、特异选择性差.许多学者采用在碳材料中加入纳米碳管等纳米材料增加碳电极的导电性，但是纳米材料的缺陷是制备困难且成本高，掺入型的纳米材料还存在分散困难的问题.与纳米材料相比，泡沫镍价廉易得，具有导电性能优良，比表面积大和多孔结构，易于实现表面修饰等特点，广泛应用在电池电极材料、电化学超级电容器、催化剂载体和电化学电极材料等方面[3-5].已经有报道采用水热法在泡沫镍基底上直接生长氢氧化镍制备葡萄糖催化电极.但是目前尚未发现直接将石墨等碳材料填充于泡沫镍基底制备生物传感器电极后应用在农药检测的报道.

壳聚糖是甲壳质的脱乙酰衍生物，具有良好的生物相容性、无生物毒性，分子中的氨基对各种蛋白质具有较高的亲和力，能在温和条件下固定，酶效率高，活性好，长期保存酶活性损失低.其三维多空结构是酶、抗体等生物活性物质良好的固定化载体，广泛的应用于生物传感器中[6-7].TCNQ(7，7，8，8-四氰基苯醌二甲烷)具有较好的电催化活性，常被用来解决酶催化底物硫代胆碱反应过程中需要较高电位的问题[8-10].目前为止，尚未看到用壳聚糖分散TCNQ的报道，因此笔者将尝试使用将TCNQ分散壳聚糖中制备电子媒介体层.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

材料：石墨粉(国药集团化学试剂有限公司)，丙酮，乙醇，环己酮，醋酸纤维素，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，均为分析纯试剂，TCNQ购于上海笛柏化学品技术有限公司，乙酰胆碱酯酶(200 U/mg)，氯化乙酰胆碱(≥98%)，戊二醛(≥98%)，牛血清蛋白(≥98%)均购于南京都莱生物有限公司，壳聚糖(乙酰化≥90%)购于如吉生物科技有限公司，毒死蜱购于市场,实验用水为去离子水.

仪器：电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)，PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂)，微量进样器(上海安亭微量进样器厂)，循环伏安法使用三电极体系：研究电极为自制胆碱酯酶电极，参比电极为饱和甘汞电极(上海康宁光电科技有限公司)，辅助电极为不锈钢电极.

1.2 实验方法

1.2.1 整体结构图

图1为制备的以泡沫镍/石墨为载体的乙酰胆碱酯电极的整体结构图.

图1 以泡沫镍/石墨为载体的乙酰胆碱酯电极的整体结构图

1.2.2 乙酰胆碱酯电极的制备

1) 泡沫镍载体层的制备

6%醋酸纤维素溶液的配置：按计量比将醋酸纤维素加入到体积比1∶1的环己酮与丙酮的混合溶剂中，放置72 h使之充分溶解.

石墨填充：取石墨(500目)和6%的醋酸纤维素溶液(石墨和醋酸纤维素溶液的质量比为30∶70)，混合成浆料后放在坩埚中充分研磨，将浆料填充到裁剪好的具有一定尺寸的泡沫镍(经过丙酮，盐酸，乙醇和去离子水处理)中，放在通风橱中干燥后碾压成0.5 mm厚度的薄片.

基板层制备：将步骤2所制备的泡沫镍载体用胶黏剂连接在预先裁减好的PVC板上，PVC板尺寸和泡沫镍载体尺寸一致，尺寸大小为40 mm×2 mm.

2) TCNQ修饰层的制备：按计量比将饱和TCNQ溶液和1%壳聚糖溶液混合均匀后，取适量混合液滴涂于电极表面；① TCNQ饱和溶液的配制：将TCNQ溶于2 mL丙酮中至不能溶解为止，得到饱和的TCNQ溶液；② 1%壳聚糖溶液的配制：按计量比将壳聚糖加入到1%稀乙酸水溶液中充分溶解，放置于4 ℃冰箱中备用.

用钢制模具将与步骤1相同的石墨和醋酸纤维素的混合浆料填充在预先裁减好的PVC板上，干膜厚度为0.5 mm.然后在碳电极表面修饰TCNQ，得到无泡沫镍载体的碳电极A.

3) 乙酰胆碱酯酶层的涂制：按计量比将0.1 mg/μL乙酰胆碱酯酶溶液和5%戊二醛溶液(二者的溶剂均为pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液)以及1%壳聚糖溶液混合后，滴于步骤2)制备的电极上，并使其完全覆盖壳聚糖-TCNQ膜，置于室温下晾干.

1.2.3 乙酰胆碱酯电极的检测

1) 乙酰胆碱酯酶电极的循环伏安测试方法

以乙酰胆碱酯酶电极作为工作电极，在pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液(含0.10 mol/L KCl)中浸润30 min后，以铂电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，以含1 mmoL/L氯化乙酰胆碱的磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0，含0.1 mol/L KCl)为测试液，室温下用电化学工作站测定氯化乙酰胆碱的氧化电流，扫描速度为50 mV/s.乙酰胆碱酯酶电极检测有机磷农药的工作电位采用由酶电极的循环伏安图的氧化峰电位.

2) 用毒死碑检验乙酰胆碱酯电极的有效性

毒死碑一类常见的广谱高效低毒的有机磷农药，大量使用会造成严重的环境污染、药害及通过影响神经系统发育导致人畜中毒，尤其是蔬菜食品中有机磷农药引起中毒现象十分严重[11-12].

胆碱酯酶电极使用前，先将电极在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中采用循环伏安法反复扫描，使电极活化并达到稳定状态．

有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶催化水解的正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关.检测胆碱氧化电流，计算AChE的抑制率为

A=(I0-I)/I0×100%

式中:A为酶的抑制率；I0为未被有机磷或氨基甲酸酯农药抑制的酶电极稳定响应电流(空白电流)；I为被有机磷抑制后酶电极的稳态响应电流.理论上的检测下限可以定义为10%时的抑制率(I10%)所对应的抑制剂浓度.

2 结果与讨论

2.1 酶电极的制备工艺讨论

2.1.1 泡沫镍填充石墨载体修饰TCNQ对胆碱的催化作用

在含和不含泡沫镍的两种载体上涂TCNQ但不涂胆碱酯酶，获得无泡沫镍碳电极A和有泡沫镍碳电极B，在1.0 μmol/L胆碱溶液中测试其催化性能，两种电极对胆碱的催化性能如图2所示.由图2可知采用泡沫镍为基体的电极催化循环伏安图中氧化峰形状特别尖锐，这可能是因为泡沫镍具有三维多孔结构、大的比表面积和优良的的导电性，而单纯石墨电极的电阻较大，其氧化电位也校正，其他物质也容易在该电位发生氧化还原反应而产生干扰．

图2 TCNQ修饰电极在1.0 μmol/L胆碱溶液中循环伏安图

2.1.2 TCNQ含量及TCNQ和壳聚糖溶液比例对胆碱酯酶电极的影响

1) TCNQ含量对胆碱酯酶电极的影响

图3给出了TCNQ修饰层中TCNQ占TCNQ与壳聚糖之和的百分比对胆碱酯酶电极氧化峰电流的影响.从图3可以看出:随着电子媒介体TCNQ的增加，胆碱酯酶电极的氧化峰电流也随着增加，但是当饱和TCNQ丙酮溶液与壳聚糖溶液混合比例超过1∶1.5以后，胆碱酯酶电极的氧化峰电流却减小，这是由于粘结剂壳聚糖的量过小，TCNQ修饰层不稳固，TCNQ会脱落或者流失.

图3 TCNQ的用量对酶电极性能的影响

2) 壳聚糖溶液与酶的比例对胆碱酯酶电极响应电流的影响

分别配置壳聚糖溶液和酶溶液比例为2∶1，1∶1，1∶2混合溶液，取6 μL滴于电极TCNQ修饰层上，并使其完全覆盖修饰层，置于室温下晾干．在不同浓度的底物溶液中测试酶电极催化反应的响应电流值．图4表明：酶修饰电极都随着底物浓度不断的增加，响应电流逐渐增大，酶溶液比例低时，酶催化不完全，氧化电流较小；酶溶液比例高，壳聚糖不能完全包覆生物酶材料，活化和检测过程中易造成酶活性的流失．m(壳聚糖凝胶)∶m(酶)=1∶1时，响应电流最大.

图4 氯化乙酰胆碱浓度对响应电流的影响

2.2 酶电极性能测试

2.2.1 固定化酶膜电极的循环伏安特性

将所制得的壳聚糖/TCNQ/胆碱酯酶电极在pH为7.0的测试溶液中，采用循环伏安法检测胆碱酯酶电极在氯化乙酰胆碱溶液中的电化学行为，结果如图5所示.

图5 TCNQ修饰电极在磷酸盐缓冲溶液中和氯化乙酰胆碱溶液中循环伏安图

由图5可知：胆碱酯酶电极在+0.32 V出现一个明显的氧化峰，在-0.1 V左右出现一个还原峰.文献中报道氧化峰的较好的水平一般也高于0.4 V，这表明使用泡沫镍载体可以大幅度降低胆碱酯酶电极的工作电位，这可以避免农药传感器工作电位过高导致其它物质氧化而引起干扰．

2.2.2 底物浓度的确定

胆碱酯酶传感器检测有机磷类农药是基于农药对生物活性酶的抑制作用，将胆碱酯酶固定在电极表面并经稳定化处理，选择相应的胆碱作为底物，将酶电极插入底物溶液中，底物被酶催化发生水解，水解产物在电极表面氧化并产生氧化电流.有机磷类农药同胆碱酯酶活性中心发生不可逆结合，从而导致酶失去活性而无法进行酶促反应，但高浓度底物的存在可能会阻碍有机磷农药对酶的抑制作用，降低有机磷农药对酶活性的实际抑制率，从而影响测定结果的准确性．为使农药对酶活性的抑制达到最大化，同时为了保证该酶传感器能显示较高的酶活性，确定底物浓度为1.2 mmol/L(图4)．

2.2.3 农药浓度与抑制率的关系

以毒死蜱农药浓度的对数lgC与抑制率的关系作图,如图6所示.结果表明：乙酰胆碱酯酶电极的抑制百分率与毒死蜱农药浓度的对数lgC在范围均呈现良好的线性关系，线性方程为I%=12.88lgC+130.83，相关系数R2=0.993，其检测限可达到6.95×10-11mo1/L．

图6 不同浓度的农药对固定化酶的抑制率曲线

2.2.4 酶电极的稳定性及重现性

将制备好的固定化酶电极置于4 ℃条件下保存放置40 d后，测定氯化乙酰胆碱的氧化电流，响应信号为原来的87%，可以看出酶电极的响应电流在整个保存期内仅下降13%．这表明该酶电极具有很好的稳定性和较长的使用寿命，这为研制酶型电化学生物传感器奠定了很好的基础．

3 结 论

采用酶抑制法对有机磷农药毒死碑进行检测.以泡沫镍填充石墨作为导电载体，戊二醛为交联剂，壳聚糖固定TCNQ作为电子媒介体修饰层，最后采用壳聚糖包埋法固定乙酰胆碱酯酶制备成一次性检测有机磷农药的胆碱酯酶电极.探讨了泡沫镍基体、TCNQ和壳聚糖溶液比例、壳聚糖溶液与酶的比例、底物浓度等多个因素对制备的胆碱酯酶电极的影响.结果表明：1) 泡沫镍具有良好的导电性有助于降低氧化电位．这可能是因为泡沫镍具有三维多孔结构、大的比表面积和优良的的导电性，当饱和TCNQ丙酮溶液与壳聚糖溶液混合比例为1∶1.5和壳聚糖溶液与酶液比为1∶1时，电极响应电流最大.2) 合适的底物浓度为1.2 mmol/L.3)胆碱酯酶电极的抑制百分率与毒死蜱农药浓度的对数lgC在一定范围内呈现出良好的线性关系，其检测限可达到6.95×10-11mo1/L，将制备好的固定化酶电极置于4 ℃条件下保存放置40 d后检测，酶电极的响应电流仅下降13%．这表明该酶电极具有很好的稳定性和较长的使用寿命．

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