王淑菁，付 瑞，李晓波，王 吉，卫 礼，巩 薇，贺争鸣，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所；国家实验动物质量检测中心，北京 100050)

树鼩(tree shrew,Tupaiabelangeri)，属于攀鼩目树鼩科，主要生活在热带和亚热带森林、灌丛、村落附近，在东南亚和我国云南、广西、海南、贵州等地有较多分布。树鼩被认为是灵长类最亲密的近亲，已有报道表明树鼩非常适合用于研究人体的近视、心理应激和肝炎等问题[1]。因此，树鼩作为一种新型实验动物资源越来越受重视。目前研究中使用的树鼩大多来自野外或驯化后代，实验动物的质量难以保证，其自然携带病毒尚不清楚。将野生树鼩进行人工驯化、饲养、繁殖与规范化管理，对其携带的病毒、细菌、寄生虫指标进行控制，建立标准化的树鼩种群势在必行[2,3]。

腺病毒(adenovirus, ADV)属于腺病毒科。迄今为止已发现至少100多种腺病毒可感染人、哺乳动物和禽类。腺病毒可引起多种急性上呼吸道感染、急性眼结膜炎、急性出血性膀胱炎、腹泻等[4]。80年代以来，国内外学者从野生树鼩的咽拭子、肾组织培养物和粪便中分离出树鼩腺病毒。目前尚未建立相应的树鼩腺病毒血清学和分子生物学检测方法。因此，本研究将建立树鼩腺病毒(TAV)PCR检测方法，并进行初步应用。

1 材料和方法

1.1 阳性标准质粒和毒种

由于目前无树鼩腺病毒标准毒种及分离株，将构建阳性标准质粒作为阳性对照。查询NCBI上树鼩腺病毒(TAV)序列，选择树鼩腺病毒基因组保守特异区域(19418-19917区域)，委托Takara公司合成约500bp目的片段，插入pMD18-T载体，构建阳性标准质粒。禽腺病毒I型(CELO VR-432株)购买于ATCC，禽腺病毒III型(EDS AV127株)购于中国兽药监察所。猴腺病毒-1和猴腺病毒-20均为本科室保存。

1.2 引物设计

使用primer 5软件在TAV 19418-19917区域设计引物。上游引物:GCGGAGCGGGTTGTA GGGTA；下游引物:TCGTGCGGCTGGCGTTTT。委托Takara公司合成。

1.3 样本采集及DNA提取

样本均为云南来源树鼩。无菌采集60份树鼩EDTA抗凝血，使用Qiagen的 Dneasy Blood & Tissue Kit 试剂盒(Cat.No69504)提取血DNA。采集56份树鼩粪便，使用Qiagen的DNA Stool Mini Kit的试剂盒(Cat.No51504)提取粪便DNA。详细操作根据产品说明书。

1.4 PCR扩增体系

PCR反应体系为25 μL，包括：10 x PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ddH2O 17.35 μL，引物各1 μL，DNA 1 μL，HS Taq酶0.15 μL。PCR反应条件为：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，退火温度 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR产物进行琼脂糖电泳测定。PCR产物送Takara公司进行序列测定。

1.5 特异性测定

将扩增得到的目的片段测序，与NCBI序列比对确定是否为特异性片段。提取禽腺病毒I型、禽腺III型、猴腺病毒-1，猴腺病毒-20，考察该方法的特异性。

1.6 灵敏度测定

阳性标准质粒的DNA浓度为13.5 μg/mL，将其倍比稀释从13.5 ×100至13.5 × 10-9μg/mL，以考察该PCR方法的灵敏度。

1.7 初步应用

使用该PCR方法检测60份树鼩血DNA及56份树鼩粪便DNA。

2 结果

2.1 反应体系的建立

TAV经特异性扩增得到495 bp目的片段，将扩增得到的目的片段经测序后，与NCBI网站上的序列一致率为100%。

2.2 特异性测定

以禽腺病毒I型、禽腺III型、猴腺病毒-1，猴腺病毒-20做对照，结果显示仅树鼩腺病毒阳性质粒扩增得到495 bp目的片段(图1)。

2.3 灵敏度测定

倍比稀释树鼩腺病毒阳性质粒DNA，浓度从13.5 ×100至13.5 × 10-9μg/mL，结果显示其灵敏度至13.5 ×10-7μg/mL(图2)。

2.4 初步应用

提取60份树鼩血DNA，PCR方法检测树鼩腺病毒结果均为阴性。提取56份树鼩粪便DNA，使用该引物扩增，有些DNA样品在495 bp左右出现两条疑似条带(图3)。由于这两条带片段大小十分相近，无法判定哪条是所扩增的目的条带，即495 bp-A、495 bp-B(图4)，将两条带均切胶纯化后测序。测序得到的序列与NCBI网站序列比对，495 bp-A与树鼩腺病毒序列一致，说明该条带为目的片段；而495 bp-B与亚希热菌属序列一致率为93%，为非特异扩增。此外，将495 bp-A与495 bp-B比对，无任何相似序列。

M：100 bp marker；1：树鼩腺病毒阳性质粒；2：禽腺病毒I型；3：禽腺病毒III型；4：猴腺病毒-1；5：猴腺病毒-20；6：阴性对照

M：100 bp marker； 1：13.5 μg/mL； 2：13.5 ×10-1 μg/ml； 3：13.5 ×10-2 μg/mL； 4：13.5 ×10-3 μg/mL； 5：13.5 ×10-4 μg/mL； 6：13.5 ×10-5 μg/mL； 7：13.5 ×10-6 μg/mL； 8：13.5×10-7 μg/mL； 9：13.5 ×10-8 μg/mL.

M：100 bp marker；TAV：树鼩腺病毒阳性质粒；1-20、22-41、43-58： 56份树鼩粪便DNA；21、42、59：阴性对照

使用DNAstar软件将495 bp-A序列与NCBI网站上提供的树鼩腺病毒、猴腺病毒I型、人腺病毒、禽腺病毒I型及III型序列进行同源性比对，并作出遗传进化树(图5、6)。由图可知，TAV-495-A与树鼩腺病毒比对一致率为100%。与禽腺病毒相比，树鼩腺病毒与同为灵长类的人腺病毒、猴腺病毒I型序列同源性最高。

3 讨论

Darai等[5]1980年报道从38份树鼩肾组织培养物中分离到1株TAV，能凝集大鼠和人“O”型红细胞。陈元鼎等[6]1987年报道，从90份成年云南树鼩大便中检测到12份腺病毒阳性样本，阳性率为3%。吴小闲等[7]1990年报道，从云南野生树鼩咽拭子、肾细胞培养物和粪便中分离出10株TAV，并鉴定为2个血清型(TAV-1和TAV-2)。韩建保等[8]使用人源ELISA试剂盒对272份野生俘获和人工繁殖的中缅树鼩血清样本进行腺病毒等六种病毒的检测，结果腺病毒IgG抗体均为阴性。

M：100 bp marker；1-4：495 bp-A条带；5：树鼩腺病毒阳性质粒；6-9：495 bp-B条带

图5 TAV-495-A与多个种属腺病毒序列的同源性比较

图6 TAV-495-A与多个种属腺病毒间的遗传进化树

本研究中由于没有标准毒株及分离株，人工构建了阳性标准质粒作为阳性对照。根据NCBI网站提供的TAV序列，通过与人腺病毒、猴腺病毒、鼠腺病毒及禽腺病毒的序列比对，选择其特异区域(即19418-19917区域)人工合成一段DNA序列，插入pMD18-T载体，构建了阳性标准质粒。

根据构建的阳性标准质粒的序列，设计1对特异性引物，并进行反应体系的优化，建立了TAV的PCR检测方法，结果显示该方法特异性好，灵敏度可至13.5 x10-7μg/mL。

使用该PCR方法对60份树鼩血DNA检测，结果均为阴性。对56份树鼩粪便DNA检测，结果显示有目的条带扩增，此外发现有非特异性条带扩出。由于非特异性条带与目的条带的大小相近，对两个片段均进行测序验证。结果显示，测序证实树鼩粪便中TAV感染率为42.9%，与PCR扩增结果一致。非特异条带的测序结果与亚希热菌属序列一致率为93%，这说明粪便样本中可能存在这类菌属感染。实验中对56份树鼩粪便进行DNA提取时，未对粪便进行稀释后除菌过滤，而是将粪便中所含的病毒、细菌DNA均进行提取后实验。这提示做病毒PCR检测时，最好将样本除菌过滤，以降低细菌的非特异性扩增的几率。

本研究对云南来源树鼩粪便样本检测中，显示腺病毒的阳性率达42.9%。树鼩作为近年来最有潜力的实验动物之一，并进行系统的实验动物化工作，其病毒感染情况应引起实验动物科技界的足够重视。

参考文献：

[1] 沈培清, 郑红, 刘汝文, 等. 中国树鼩实验动物化研究进展和展望 [J]. 动物学研究, 2011, 32(1): 109-114.

[2] 角建林, 刘汝文, 陈丽玲, 等. 树鼩资源的开发利用与标准化研究——我国实验动物资源建设发展战略探讨 [J].中国比较医学杂志, 2009, 19(7): 73-78.

[3] 贺争鸣.我国资源动物的实验动物化潜力与展望 [J]. 中国比较医学杂志, 2010, 20(3):1-7.

[4] 殷震, 刘景华. 动物病毒学 [M]. 北京: 科学出版社, 1997：1104-1129.

[5] Darai G, Matz B, Flügel RM, et al. An adenovirus from tupaia (tree shrew), growth of the virus, characterization of viral DNA and transforming ability [J]. Virology, 1980, 104-122.

[6] 陈元鼎, 戴国珍, 李军, 等. 树鼩大便中腺病毒的实验研究 [J]. 中国人兽共患病杂志, 1987, 3(3): 2-4.

[7] 吴小闲, 唐恩华, 张新生, 等. 树鼩腺病毒(I和II型)的生物学性状、抗原关系和血清抗体的研究 [J]. 中国医学科学院学报, 1990, 12(2): 153-156.

[8] 韩建保, 张高红, 段勇, 等. 中缅树鼩自然感染六种病毒的血清流行病学 [J].动物学研究, 2011, 32(1): 11-16.