徐玉环，刘 颖，徐艳峰，黄 澜，李彦红，韩云林，邓 巍，秦 川，朱 华

(中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室 北京 100021)

目前研究小鼠胚胎发育，国内外大多采用冰冻切片。但对于较大的小鼠胚胎和新生鼠由于各脏器的结构、密度差异较大易造成组织冻结不均匀，影响切片及染色效果。另外，冰冻切片不容易制作较薄的切片，染色后组织结构不如石蜡切片清晰。虽然新的病理技术不断涌现，石蜡切片还是应用最广，结果较可靠的一种病理制片技术。国内外学者通过石蜡切片研究小鼠胚胎发育，在脱水处理小鼠整体胚胎时多按不同胚龄和日龄分开操作，对于同时处理不同胚龄及日龄的小鼠，还未见报道。我室引入全自动密闭式组织脱水机多年，在实验动物大体标本石蜡切片制备中的应用已较为成熟。本文尝试使用全自动密闭式组织脱水机处理不同日龄的小鼠整体胚胎组织和新生鼠组织，进行包埋切片并进行观察比较。

1 材料和方法

1.1 仪器及试剂

全自动密闭式组织脱水机，Leica ASP300型(德国原装进口)。不锈钢脱水篮，塑料包埋盒。4%中性甲醛、乙醇、二甲苯、苏木素及伊红Y染色液均为国产试剂(北京益利精细化学品有限公司)，石蜡(lot#1305083，Leica)。

1.2 不同胚龄及日龄小鼠整体标本的制备

断颈处死孕鼠，取出胚胎，用0.01 mol/L的PBS清洗。胚龄14.5、15.5、16.5 d的胚胎清洗后直接置于4%中性甲醛中固定24 h以上，不需要取材；

我们原来制备不同胚龄及日龄小鼠整体标本是分开进行的。由于胚龄17 d皮肤具有成体皮肤组织结构特征，18 d以后皮肤的组织结构基本保持不变。因此在本次小鼠胚胎制备过程中，对胚龄17.5 d、18.5 d及日龄0、1、2 d小鼠的固定、取材方法及脱水程序进行了改进：在整体固定前先在局部注入固定液。由于不同胚龄的小鼠及新生鼠胸腹部及脑部体积相差不大，注射的固定液体积基本相同(表1)。对取材的厚度(表1)和二甲苯透明时间也做了改进(表2)。

表1 改进前、后不同胚龄及日龄小鼠整体标本制备的比较

表2 改进前、后脱水程序设定的比较

1.3 组织石蜡切片及染色

脱水后的组织经石蜡包埋制成蜡块，常规切片(切片厚度4 μm)。石蜡切片经脱蜡至水进行HE染色，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后中性树脂封片。

2 结果

2.1 胚龄18.5 d的小鼠胚胎HE染色比较

在小鼠胚胎制备过程中，我们选取18.5 d的小鼠胚胎对取材方法及脱水程序进行摸索改进。根据常规实验动物脱水程序设定的18.5 d的小鼠胚胎经HE染色可见(图1)：改进前，不能完整切片；改进后，切片完整，各组织结构清晰。

图1 改进前后18.5 d小鼠整体胚胎比较

2.2 小鼠整体胚胎及新生鼠HE染色结果

改进后的方法同样适用于小鼠整体胚胎14.5、15.5、16.5、17.5 d及新生鼠0、1和2 d。用改进后设定的程序经全自动密闭式组织脱水机制得的小鼠整体胚胎及新生鼠的蜡块，切片时手感柔润，蜡片平整光滑润泽。染色后镜下观察可见胚胎及新生鼠各组织结构完整，层次清晰。如图2所示：

图2 胚龄14.5 d、15.5 d、16.5 d、17.5 d、18.5 d及日龄0 d、1 d、2 d的小鼠HE染色结果。E表示胚龄；D表示日龄。

3 讨论

观察大体标本后取材，制作石蜡切片，并对切片染色进行光学显微镜观察，以对疾病作出诊断的常规病理技术是病理技术和病理诊断的基础和核心，具有重要的实验和临床应用价值和不可替代的地位[1]。

疾病的研究和早期的胚胎发育联系越来越紧密，新的基因工程技术的广泛应该用使得胚胎研究成为基础研究的重要组成部分[2]。胚胎发育迅速，不同日龄的胚胎在组织结构上相差很大[3]，目前可查的文献记录中多使用手工操作对胚胎进行脱水包埋，以适应不同日龄胚胎的切片要求[4,5]。但手工操作耗时费力，且很难进行批量操作，且由于多种条件的限制重复性较差。全自动密闭式组织脱水机以其安全高效和良好的处理效果等优点，受到病理技术人员的青睐，在病理学、解剖学、动物学等实验领域广泛应用[6,7]。本研究通过实验，不断摸索，成功利用全自动密闭式组织脱水机制备了不同胎龄小鼠整体胚胎及不同日龄的新生鼠标本。

通过实验处理小鼠整体胚胎及新生鼠组织，要注意以下几点：首先是固定，固定一定要彻底，这是第一步也是不可逆转的一步。由于不同时段胚胎大小不同，各个脏器的发育程度也不同，所以固定液浸入各脏器的时间有差别。尤其是肝脏，肺脏及脑部，即使固定时间超过24 h，由于固定液难以及时完全浸入到组织内部，最后也会出现自溶现象。因此，对胎龄大于18 d的胚胎和新生鼠在整体固定前

增加了局部注射固定这个步骤。在注射过程中要注意两点：缓慢注射避免造成对脏器的挤压；选择腔隙或组织分布较稀疏的部位注射，以免损伤组织，影响组织学观察。其次是取材，取材厚度不宜超过3 mm，尤其是脑部组织。由于脑部组织磷脂含量高且与水结合牢固，不易脱出。取材太厚，会造成脱水不完全，不能完整切片。脱水时间也是方法中应该注意的，要照顾到胚胎的各个脏器均脱水完全又不能过度脱水。胚龄17 d以后皮肤具有成体皮肤组织结构特征，需要稍微增加二甲苯透明时间。和其他脏器相比，脑部所需脱水时间也要长一些，而肝脏和脾脏却易脱水过度。在本次研究中，经过多次尝试，在其它步骤保持不变的前提下，将第一步二甲苯透明的时间增加了5 min，使取材后不同胚龄及新生鼠整体标本可以同时脱水。最后就是脱水机换液，累计脱水达到600块时，脱水机要换液，但换液时不要把全部液体更换成新的，而是逐级上移，只更换最后一个步骤的液体，使脱水过程更柔和。

应用改进过的方法处理的小鼠整体胚胎及新生鼠，其切片同样可以用于免疫组化及特殊染色，这为小鼠胚胎及新生鼠的发育研究提供了基础。

参考文献：

[1] 董学易, 孙保存, 赵秀兰, 等. 常规组织制片技术在病理学实验教学中的应用 [J]. 基础医学教育, 2013, 15(7): 685-686.

[2] Pérez-Pomares JM, Foty RA. Tissue fusion and cell sorting in embryonic development and disease: biomedical implications [J]. Bioessays, 2006, 28(8): 809-821.

[3] Theiler K. The house mouse atlas of embryonic development (second printing) [M]. Springer-Verlag, New York. 1989: 1-185.

[4] 冉黎, 张全波, 陆长青, 等. 不同时期大鼠整胚石蜡标本的制备 [J]. 四川解剖学杂志, 2007, 15(3): 14-16.

[5] 刘淑琴, 秦建民, 曾锦章, 等. 不同时期小鼠胚胎整体石蜡标本的制备技术[J]. 解剖学杂志, 2005, 28(6): 721-723.

[6] 胡海霞, 刘俊堂, 熊正文. 全自动密闭式组织脱水机在石蜡切片组织处理中的应用 [J]. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2007, 16(6): 738-739.

[7] 耿佳. 全自动密闭式组织脱水机的应用 [J]. 实用医技杂志, 2010, 17(4): 376.