屈巧凤，姜大成

(长春中医药大学，长春 130117)

林蛙皮含有胶原蛋白、透明质酸、多肽、金属元素等多种化学成分[1-4]。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的25%～30%，相当于体质量的6%[5-6]。胶原蛋白因其独特的结构和功能，被广泛的应用于食品、化妆品、医学、造纸等领域[7-11]。本文从药材粉碎度、加水量、酶的种类3个方面探讨从林蛙皮中提取胶原蛋白的影响因素及优化条件。

1 实验材料

取中国林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)腹部的皮，干燥，将其粉碎，过60目筛，备用。微型植物试样粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂)、TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)、ZK-82B型真空干燥箱(上海市实验仪器总厂)、HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)、柠檬酸(天津市福晨化学试剂厂)、柠檬酸钠(天津市福晨化学试剂厂)、对二甲氨基苯甲醛(天津市光复精细化工研究所)、冰醋酸(北京化工厂)、L-羟脯氨酸(L-Hydroxyproline，批号111578-200201，中国药品生物制品检定所)。

2 实验方法

2.1 林蛙皮中胶原蛋白的提取方法 将上述粉碎好的林蛙皮粉末称量5 g，加入适量的蒸馏水，以浸没为准，再分别加入适量的胰蛋白酶和柠檬酸，在30 ℃下提取48 h,过滤，收集滤液，将滤液离心，3 000 r/min，离心15 min，收集上清液，冷冻干燥。即得胶原蛋白粗提物[12]。

2.2 胶原蛋白的含量测定方法 称量2 g胶原蛋白粗提物，加入50 mL 6 mol/L的盐酸，120 ℃消解8 h，放冷，挥去盐酸，过滤，蒸馏水定容至100 mL，取1.5 mL，以1 mol/L的NaOH调整PH到6.0，定容至25 mL，吸取1 mL，加入1 mL蒸馏水、1 mL柠檬酸缓冲溶液和1 mL氯胺T，25 ℃保温氧化10 min，然后加入3.5 mol/L高氯酸溶液1 mL，室温放置10 min，加入对二甲氨基苯甲醛试剂1 mL，震荡均匀(其低温易结晶，使用前应加热)，在65 ℃水浴中保温10 min，使其显色，于558 nm下测其吸光度[13-14]。羟脯氨酸与胶原蛋白质量换算公式如下：M=C×稀释倍数×总体积×换算系数，式中M—林蛙皮中胶原蛋白的含量；C—消解液中羟脯氨酸的质量浓度；换算系数—10(两栖类动物胶原蛋白中羟脯氨酸的大体含量)[15]。

3 结果

3.1 药材粉碎度的考察 由于林蛙皮较为坚韧并且质地较轻，胶原蛋白网络密集，直接水解效果较差，将林蛙皮进行适当的粉碎可以增加林蛙皮的表面面积，提高水解效果，具体操作如下:取林蛙皮100 g，用粉碎机进行适度粉碎，分别筛取粒径为2 mm以下粉末、5 mm以下粉末、10 mm以下粉末各20 g，分别加适量的蒸馏水，以完全浸没为准，加0.05 g胰蛋白酶，10.08 g柠檬酸，37 ℃时提取48 h，过滤，将滤液冷冻干燥，测定其中胶原蛋白的提取量。通过比较发现，林蛙皮的粉碎度越大则胶原蛋白的含量越高，所以林蛙皮在提取时必须要粉碎，考虑到粒径在2 mm以下比较难控制，并且粉碎过程中产生细粉较多，所以确定林蛙皮的粉碎度控制在5 mm以下即可，见表1。

表1 粉碎度、加水量、酶的种类对胶原蛋白含量的影响

3.2 加水量的考察 林蛙皮适度粉碎，取5 mm以下粉末3份，每份20 g，分别加入50、60、70 mL蒸馏水，0.05 g胰蛋白酶，10.08 g柠檬酸，37 ℃时提取48 h，过滤，将滤液冷冻，测定其中胶原蛋白的提取量。通过试验发现，加入60 mL的水时胶原蛋白的含量最高，因此，选择加入60 mL的水，结果见表2。

表2 优选胶原蛋白提取工艺条件正交试验因素水平表

3.3 酶的种类考察 林蛙皮适度粉碎,取5 mm以下的粉末3分,每分20 g，分别加入60 mL蒸馏水，0.05 g胃蛋白酶、0.05 g胰蛋白酶、0.05 g木瓜蛋白酶，10.08 g柠檬酸，37 ℃时提取48 h ，过滤，将滤液冷冻干燥，测定其中胶原蛋白的提取量。结果显示当加入等量的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶时，胰蛋白酶能够提取出更多的胶原蛋白，因此林蛙皮酶解时选用胰蛋白酶，结果见表3。

表3 胶原蛋白提取工艺条件正交试验结果表

3.4 正交实验优化 见表4。

表4 胶原蛋白提取工艺正交试验结果方差分析表

按照L9(34)正交表进行试验,称取林蛙皮，粉碎成5 mm以下,共9份，每份5 g，按照表3进行试验，以胶原蛋白的含量(方法见“1.2.2胶原蛋白的含量测定”)为考核指标。根据直观分析和方差分析的结果：提取时间对试验结果影响最显著，其次为加入的柠檬酸的量，对胶原蛋白的提取影响最小的是加入的胰蛋白酶的含量，由此可见，各因素对试验结果影响的重要性依次为A>D>B>C，根据各个因素对指标的影响程度，确定胶原蛋白提取的最优工艺为：A3B3C1D2，即加水量是60 mL，提取时间是72 h，提取温度是37 ℃，加胰蛋白酶的量是1%(0.05 g)，加柠檬酸的量是0.8 mol/L。

4 结论

综上确定了林蛙皮中胶原蛋白的最佳提取工艺：将中国林蛙的腹部皮干燥，粉碎，过60目筛，取5 g，加入60 mL水，再分别加入1%的胰蛋白酶和0.8 mol/L的柠檬酸，在37 ℃下提取72 h，过滤，收集滤液，将滤液离心，3 000 r/min，离心15 min，收集上清液，冷冻干燥。即得胶原蛋白粗提物。在此优化条件下提取，胶原蛋白的提取率为67.09%。

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