韩 峰，盛 莉

(解放军第281医院，河北 秦皇岛 066100)

在军事活动、工农业生产和日常生活中，海水淹溺事件时有发生。海水进入肺内容易引起海水淹溺型急性肺损伤/呼吸窘迫综合征(seawater drowning induced acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,SWD-ALI/ARDS)。肺泡是肺部气体交换的主要部位，也是肺的功能单位。海水对肺泡上皮细胞的直接损伤以及由此导致的低氧血症和酸中毒是肺损伤及呼吸窘迫综合征发生的主要原因[1]。在正常肺组织的发育、成熟以及ALI发生、发展过程中，肺泡上皮细胞凋亡都具有重要作用。ALI时，肺泡上皮凋亡可导致炎症、水肿和肺纤维化[2-3]，以及肺表面活性物质的减少。既往实验已证实海水可导致模型大鼠包括肺泡上皮细胞在内的肺组织细胞凋亡[4]。

近年来一些研究工作已经证实了丹参酮ⅡA[5-6]对ALI治疗具有重要价值[7]。因此，本课题从观察海水对人肺泡上皮A549细胞凋亡的影响出发,进一步探讨丹参酮ⅡA对海水诱导的A549细胞凋亡的抑制作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 人肺泡上皮细胞株A549由第四军医大学病理与病理生理学教研室惠赠。丹参酮ⅡA磺酸钠(中国药品生物制品检定所，纯度>98.0%)，RPMI1640培养基(北京赛默飞-世尔)，胎牛血清(北京元亨金马),兔抗人FasL、Fas多克隆抗体(美国Abcam公司)，兔抗人cleaved caspase-8单克隆抗体(美国cell signal公司)，Annexin v-FITC/PI试剂盒(美国BD公司)，CK40-F200型倒置显微镜(日本Olympus公司)，二氧化碳培养箱(德国Kendro公司)，FACS-Calibur流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 细胞培养 A549细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素各100 u的RPMI-1640培养液，37 ℃、5%CO2条件下常规传代培养。取对数生长期细胞进行干预处理。

1.3 海水的制备 人工配方海水根据中国国家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我国东南沿海海水主要成分配制[8]，无菌网筛过滤。按配方海水和RPMI1640培养基2∶3的比例(v/v)，配制成40%的海水。

1.4 实验分组 在6孔培养板的每一孔中接种6×106个A549细胞,24 h后细胞贴壁进行实验。实验设3个组：空白对照组、海水浸泡组和丹参酮ⅡA干预组。海水浸泡组以2 mL 40%海水浸泡细胞6 h。丹参酮ⅡA干预组以2 mL 40%海水另加入丹参酮ⅡA 25 μg/mL浸泡细胞6 h。此前实验已表明[9]，丹参酮ⅡA在25 μg/mL浓度时毒副作用最小，对海水浸泡A549细胞的保护作用最佳，故本研究选用25 μg/mL丹参酮ⅡA作为干预剂量。空白对照组仅加入同等量的2 mL无血清培养基，其他处理同。每组做3平行孔，统计时3孔实验数据取平均值。

1.5 细胞形态学观察 通过倒置相差显微镜观察各组A549细胞形态以及活性的变化。

1.6 FITC-Annexin V/PI双染法测定细胞凋亡率 干预完毕后，将各孔中的细胞培养液吸出至一合适离心管内，每孔再加入适量0.25%胰酶消化液，消化2～3 min后加适量含血清培养基终止消化，吹打细胞至完全脱落。将细胞悬液连同培养液转移至离心管内,1 000×g离心5 min，弃上清，再加入无血清培养基2～3 mL至离心管内重悬细胞，然后用膜联蛋白V-FITC及PI染色，流式细胞仪上机分析检测细胞凋亡率。

1.7 蛋白质免疫印迹法(Western blotting)分析FasL、Fas及cleaved caspase-8蛋白表达 常规消化、收集、裂解细胞，提取蛋白，考马氏亮蓝法测定蛋白质浓度,煮沸变性后12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，250 mA电流PVDF半干法转膜30 min，10%脱脂奶粉室温下封闭2 h，然后分别加入FasL抗体(1∶100)、Fas抗体(1∶200)、cleaved caspase-8抗体(1∶200)及内参β-actin抗体(1∶5 000)，4 ℃过夜。TBST摇床洗膜3次，10 min/次，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)室温下孵育2 h，TBST摇床再洗膜3次，10 min/次，最后增强化学发光法(ECL)显色,胶片显影和定影。将胶片进行扫描，利用凝胶图象分析系统(BioSens Gel Imaging System)检测各目标条带的灰度值。

2 结果

2.1 细胞形态学观察 显微镜下观察，对照组A549细胞胞体明亮，呈上皮型贴壁均匀生长，细胞间结构紧密，无悬浮细胞，呈圆形或多角形，核大，细胞轮廓清晰，生长状态良好。海水浸泡组可见大量细胞脱壁悬浮，生长密度下降，细胞间接触变松，细胞形态大小不一，圆形固缩，胞体变暗。丹参酮ⅡA干预组细胞未出现明显悬浮,少数皱缩、体积变小、透光性减弱，与海水浸泡组相比，细胞生长状况明显改善。

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡结果 海水作用A549细胞后较对照组细胞凋亡率显著增高，差异有统计学意义(P<0.01)。丹参酮ⅡA干预组细胞凋亡率与海水浸泡组相比明显下降(P<0.01),说明丹参酮ⅡA对海水处理的A549细胞有一定的保护作用(图1和表1)。

图1 流式细胞仪检测A549细胞凋亡(B1象限为死细胞和细胞碎片,B2象限为晚期凋亡细胞，B3象限为活细胞,B4象限为早期凋亡细胞)

组 别细胞凋亡率/%空白对照组 6.1±1.4 海水浸泡组 40.0±5.3## 丹参酮ⅡA干预组20.4±2.5△△

注:与空白对照组比较，##P<0.01；与海水浸泡组比较，△△P<0.01

2.3 FasL、Fas以及cleaved caspase-8蛋白表达 Western blotting结果显示(图2)，对照组FasL、Fas以及cleaved caspase-8蛋白仅见微量表达,海水处理后这3种蛋白显著增高,丹参酮ⅡA组FasL、Fas以及cleaved caspase-8蛋白表达量较海水浸泡组明显下调。

图2 Western blotting检测A549细胞FasL、Fas及cleaved caspase-8蛋白表达:1空白对照组，2海水浸泡组，3丹参酮ⅡA干预组。与空白对照组比较，**P<0.01；与海水浸泡组比较，#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

ALI肺组织的重要病理变化为肺泡上皮细胞的严重损伤。既往认为，ALI时肺部靶细胞死亡方式是坏死，但许多研究显示细胞凋亡也参与了ALI/ARDS的发病过程[10-11]。

本实验从凋亡角度探讨了海水对人肺泡上皮A549细胞的影响以及丹参酮ⅡA的保护作用。通过研究发现，海水可以引起A549细胞凋亡，同时，丹参酮ⅡA可以有效抑制海水诱导的A549细胞凋亡，下调FasL、Fas及cleaved caspase-8蛋白的表达。

肺泡上皮细胞凋亡参与ALI早期病理生理过程，抑制其凋亡能够减轻ALI[12]。肺泡上皮细胞的过度凋亡将导致结构细胞数量减少和肺组织病理变化加重。海水的化学成分十分复杂，具有高钠、高渗特性，常温海水NaCl浓度为3%～3.5%，是正常人血液生理浓度的3倍；海水中还有碘化物、硅化物及大量的钙(Ca)、镁(Mg)、锌(Zn)，锰(Mn)、铜(Cu)、锶(Sr)等重金属元素及化合物和天然放射性元素[1]。海水的直接和间接损伤导致了SWD-ALI/ARDS,而SWD-ALI/ARDS的重要发病机制则是肺泡上皮细胞在内的肺实质细胞结构和功能的受损。之前研究已证实海水可导致大鼠肺泡上皮细胞凋亡[4],本实验进一步观察了海水对人肺泡上皮A549细胞凋亡的影响，结果表明，海水可以显著引发A549凋亡。

Fas是一种分子量为45-kDa的I型膜蛋白，属于TNF受体家族，而FasL是一种分子量为37-kDa的Ⅱ型膜蛋白。Fas与FasL结合后,可迅速激活由caspase-8引发的一系列caspase级联反应，裂解DNA,诱发细胞凋亡。Fas/FasL介导的死亡受体信号途径在ALI/ARDS时肺泡上皮凋亡的调控方面发挥重要作用[13]。本实验Western blotting结果显示，海水处理的A549细胞在出现凋亡的同时，FasL、Fas及cleaved caspase-8蛋白表达明显增加，说明海水可以通过激活Fas/FasL信号通路介导A549细胞凋亡。加入丹参酮ⅡA后，上述3种蛋白的表达量明显下降，证实丹参酮ⅡA能够调控FasL、Fas及caspase-8蛋白的活化，从而有效减少A549细胞凋亡。

综上所述,丹参酮ⅡA可通过Fas/FasL介导的死亡受体信号途径抑制海水诱导的人肺泡上皮A549细胞凋亡，这为从肺泡上皮细胞凋亡角度深入研究SWD-ALI的发生机制和药物治疗提供了依据。但海水淹溺后，是否还有其他信号通路参与了肺泡上皮细胞凋亡的调节以及丹参酮ⅡA临床治疗的有效性，还有待进一步研究。

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