傅淑平， 杨 丽， 洪 浩， 偶 晨， 张荣华△

(1南京中医药大学针药结合省部共建教育部重点实验室，江苏 南京 210023;2暨南大学药学院中药教研室, 广东 广州 510632)

梓醇(catalpol)是从玄参科植物地黄中分离出来的单一有效化学成份之一，也是中国药典指定的地黄定性指标，属于环烯醚萜类化合物[1]。我们的前期研究显示，0.05～10 mg/L梓醇培养液对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的增殖均有促进作用，其中1.0 mg/L梓醇培养液对细胞的增殖作用最强，但其具体作用机制并不明确[2]。近期研究表明，Wnt信号通路在BMSCs自我更新过程中具有重要的调节作用[3], 但其是否与梓醇的促干细胞增殖作用有关，尚不清楚。本研究主要在前期工作基础上，检测梓醇对BMSCs细胞周期的影响，同时观察Wnt信号通路中相关因子在此过程中的变化情况，探讨梓醇促BMSCs增殖的作用机制。

材 料 和 方 法

1 动物

清洁级(SPF)3月龄SD雌性大鼠(体重约200 g)，由南京医科大学实验动物中心提供(合格证号为0004482)。

2 药物

梓醇标准品购买于北京世纪奥科生物技术有限公司，结构式见图1，纯度经HPLC检测均大于98%，称取梓醇1 mg，溶解于10 mL低糖DMEM完全培养液中，0.22μm过滤分装，配制成为100 mg/L母液，-20 ℃保存备用。

Figure 1. The chemical structure of catalpol.

3 主要试剂

低糖DMEM培养基和胎牛血清(Gibco)，胰酶(Amresco)，EDTA和RNase A (Sigma)，碘化丙啶和Trizol (Invitrogen)，RT-PCR Kit(TaKaRa)，β-catenin抗体(Cell Signaling Technology)，ECL化学发光试剂盒(Pierce)。

4 方法

4.1梓醇对BMSCs细胞周期的影响 取生长良好的第3代BMSCs以5×107cells/L密度接种在培养瓶中，将细胞分为空白对照组与梓醇处理组，待细胞贴壁后，吸出培养液，换成无血清培养基，24 h细胞周期同步化后，各组分别加入DMEM培养液及1.0 mg / L梓醇培养液培养细胞，6 d后，待细胞汇合至90%左右，消化细胞，PBS洗2次，1 200 r/min离心4 min，制成单细胞悬液，移入离心管。加入预冷的70%无水乙醇2 mL快速混匀，固定细胞24 h，去除乙醇，用0.1 mol/L PBS洗涤2次，每次加洗液2.5 mL左右，1 200 r/min离心4 min，调整细胞浓度为1×109cells/L。加200 μL RNaseA (1 g/L)，37 ℃水浴30 min，立即放入冰浴中，再加PI染色液(50 mg/L)，避光反应30 min，FACScan流式细胞仪检测分析细胞周期。以增殖指数(proliferation index，PI)表示细胞增殖活性，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

4.2梓醇对Wnt3a、Wnt5a及Wnt11 mRNA表达的影响 取生长良好的细胞，以1×108cells/L密度接种到25 cm2的培养瓶中，待细胞周期同步化后，按2.1所述进行分组并培养6 d，细胞汇合至90%以上时，消化各组细胞，提取细胞总RNA，采用real-time PCR技术检测各组细胞中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11、β-catenin及GAPDH表达情况，引物序列见表1。参照大连宝生物有限公司的TaKaRa SYBRR ExScriptTMRT-PCR Kit说明书合成第1链cDNA，反应体系10 μL(冰上操作)，上述反应液混匀后于PCR扩增仪上42 ℃反应15 min，95 ℃反应2 min。随后取2 μL cDNA样本按照10倍梯度稀释成4～6个浓度梯度的cDNA，并以此构建目的基因及看家基因的标准曲线。利用梯度样本cDNA的Ct值作为横坐标，样本的起始拷贝数的对数作为纵坐标，分别建立目的基因和看家基因的标准曲线，并设置2～4个不加模板cDNA(以灭菌蒸馏水代替)的PCR管作为空白对照管。在相同条件下检测样本目的基因和看家基因的Ct值，利用标准曲线计算该样本的目的基因和看家基因的起始拷贝数。反应结束后，由电脑自动生成荧光扩增曲线、标准曲线以及熔解曲线。使用最大二阶倒数法进行分析。

表1 引物序列

4.3梓醇对β-catenin mRNA 及蛋白表达的影响 实验分组及培养方法同2.1，细胞培养6 d后，消化各组细胞，根据Trizol试剂使用说明同时提取细胞总RNA及总蛋白，检测各实验组β-catenin mRNA及蛋白表达情况。其中β-catenin mRNA表达情况按2.2所述方法进行检测，引物序列见表1。β-catenin蛋白表达利用Western blotting技术进行检测，GAPDH蛋白作为内参对各组数据进行均一化。具体操作如下：取20 μg总蛋白变性后，进行SDS-PAGE垂直电泳，30 mA，2 h；随后将蛋白转到PVDF膜上，250 mA，2 h；将膜取出放入含5%脱脂奶粉的TBS/T封闭液中封闭1 h，然后分别放入Ⅰ抗β-catenin(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)中孵育，4 ℃过夜；经TBS/T清洗后，再加入Ⅱ抗常温反应2 h，随后加入ECL化学发光试剂，利用化学发光仪检测目的条带，并用ImageJ图像分析软件对各组条带进行分析。

5 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 18.0软件处理，采用t检验进行统计分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 梓醇对BMSCs细胞周期的影响

从图2及表2可知，空白对照组BMSCs有(8.90±0.46)%的细胞处于S和G2/M期，经药物干预后，梓醇处理组有(17.93±1.68)%的细胞处于S和G2/M期，梓醇处理组PI值高于空白对照组(P<0.01)。

Figure 2. The effect of catalpol on cell cycle of BMSCs. A: control group; B: catalpol group.

表2 各实验组BMSCs增殖指数

2 梓醇对Wnt3a、Wnt5a及Wnt11 mRNA表达的影响

如图3所示，不同Wnt蛋白在BMSCs的mRNA表达水平不尽相同，Wnt3a表达水平较低，而Wnt5a表达水平明显高于Wnt3a与Wnt11。与空白对照组相比较，梓醇干预后，Wnt5a mRNA表达水平提高了11.73倍,Wnt11 mRNA表达水平提高了7.18倍，差异均有统计学意义(P<0.01);但Wnt3a mRNA表达水平并无明显改变。

3 梓醇对β-catenin mRNA及蛋白表达的影响

与空白对照组相比较，梓醇干预后，β-catenin/GAPDH mRNA相对表达量由0.79增加到1.04，其表达水平提高了1.3倍, 差异有统计学意义(P<0.01)，见图4A。除此之外，Western blotting结果显示，梓醇可明显提高BMSCs内β-catenin蛋白表达水平，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4B。

Figure 3. The effect of catalpol on the mRNA expression of Wnt3a, Wnt5a and Wnt11 in BMSCs.Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group.

Figure 4. The effect of catalpol on the mRNA (A) and protein (B) expression of β-catenin.Mean±SD.n=6. **P<0.01 vs control.

讨 论

细胞周期与细胞增殖的关系非常密切，通常情况下大部分的BMSCs处于静息期，但是一旦进入了细胞周期，G1和G2期明显缩短，细胞在体外就会出现高速率的扩增；且细胞进入不同的细胞周期阶段时，细胞中DNA会随着细胞周期的各期而发生变化，因此当细胞受到某些因素刺激，可使DNA 含量发生变化，从而引起细胞周期发生改变[4]。细胞增殖指数则是指S期与G2/M期DNA含量之和与S期、G2/M及G0/G1期DNA含量之和的比，它是反映细胞增殖的重要指标之一。本研究在前期证实梓醇对BMSCs增殖有促进作用后，进一步观察其对细胞周期的影响，结果表明BMSCs在未作处理时，大部分细胞处于相对不活跃的静止期即G0/G1期，PI值约为8.90%，与文献报道BMSCs的PI值在10%左右相一致[5]；而经过梓醇干预后，所培养的BMSCs S期与G2/M期DNA含量增加到17.93%，提示梓醇可通过促进大鼠BMSCs进入细胞周期，增加其增殖指数，从而达到促进细胞增殖的作用。

Wnts是一种富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，Wnt信号通路参与多种细胞过程的调节，如细胞生长、分化、功能及死亡；Wnt信号通路可分为经典Wnt信号通路和非经典的Wnt信号通路。经典Wnt信号通路又称为Wnt/β-catenin信号通路，主要是激活核内靶基因的表达；当无Wnt信号时，胞内游离的β-catenin与APC、Axin、GSK-3β结合，形成“降解复合物”，GSK-3β使β-catenin磷酸化，被SCF复合物识别，分解其多肽链，从而水解，无法进入核内发挥作用；而当有Wnt信号如Wnt3a、Wnt1、Wnt8、Wnt10b等存在情况下，Wnt蛋白与其受体Frizzled及LRP6结合，并激活其下游瀑布级联反应，抑制β-catenin降解，使β-catenin在胞内稳定的积累，并促使其进入核内激活下游靶基因的转录。一些不产生β-catenin积累信号的Wnt，包括Wnt5a、Wnt11在内的多种Wnt蛋白则通过其它方式转导信号，称为非经典Wnt信号[6-8]。研究表明，Wnt信号通路可以促进某些细胞如造血干细胞[9]、神经干细胞[10]、肿瘤细胞等[11]的自我更新和增殖。从多孔钙支架中释放出来的Wnt3a可以使移植的hMSCs获得有丝分裂原的刺激，增加β-catenin稳定性，对MSCs增殖与存活具有促进作用[12]。在未分化的MSCs扩增期间，予以Wnt3a干预，可以出现细胞数目增加，细胞增殖加速及细胞凋亡下降的结果[13]。通过抑制GSK-3β活性，增加β-catenin在胞内的积累，可有效抑制细胞凋亡[14]。另有研究表明，除了Wnt3a、Wnt1介导的经典Wnt信号可能增加β-catenin在胞内的蓄积、促进细胞增殖与存活外，Wnt5a所介导的非经典的Wnt信号通路亦可抑制未分化双能C2C12细胞、成骨细胞前体细胞及骨髓来源的OB-6成骨细胞因血清饥饿所诱导的细胞凋亡，同时还可以促进这些细胞的增殖、募集和分化，以增加细胞的存活时间[15]。由此我们也可以看出，Wnt信号的经典与非经典通路均参与了MSCs的增殖过程。为探讨梓醇促BMSCs增殖作用与Wnt信号通路的活化是否存在相关性。本实验通过运用real-time PCR和Western blotting技术分别检测了各实验组中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11、β-catenin mRNA表达及β-catenin蛋白含量变化情况，结果显示：经梓醇干预后，BMSCs中Wnt5a、Wnt11及β-catenin mRNA表达均明显升高，Wnt3a表达量无变化；但β-catenin蛋白合成明显高于空白组，说明梓醇虽然没有表现出对Wnt3a mRNA表达的增强作用，但其明显增加了β-catenin mRNA的表达量和β-catenin蛋白合成量，说明梓醇可能通过调节其它Wnt蛋白，比如Wnt1、Wnt7a等，促进胞内β-catenin的累积，激活经典Wnt信号，从而促进BMSCs增殖；另外，细胞内Wnt5a和Wnt11 mRNA表达在梓醇干预下亦明显上升，而且其提高的幅度远远高于β-catenin mRNA，提示非经典Wnt信号通路的活化也可能参与了梓醇促BMSCs增殖的过程。

综上所述，我们认为梓醇可能通过Wnt3a以外的Wnt蛋白激活的经典Wnt信号通路和由Wnt5a、Wnt11激活的非经典Wnt信号通路促使BMSCs进入细胞周期，达到促进细胞增殖的作用。但具体哪一种Wnt蛋白是梓醇促BMSCs增殖过程中Wnt经典信号通路激活的启动点？Wnt5a和Wnt11激活了哪一条非经典Wnt信号通路？经典与非经典Wnt信号通路在这一过程中的具体地位孰轻孰重？尚有待于更为深入的研究。

[参 考 文 献]

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