俞小芳 蔡洁茹 崔 萌 刘少鹏 方 艺 邹建洲 丁小强

（复旦大学附属中山医院肾内科 上海 200032）

脯氨酸羟化酶（PHD）在大鼠肾脏中的表达及PHD抑制剂对5/6肾切除大鼠的作用

俞小芳 蔡洁茹 崔 萌 刘少鹏 方 艺 邹建洲 丁小强△

（复旦大学附属中山医院肾内科 上海 200032）

目的观察脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase domain enzyme，PHD）在肾脏内的生理性表达及在慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）进程中的动态表达变化，探讨不同时机PHD抑制剂治疗对CKD的作用。方法雄性SD大鼠行5/6肾切除后（以下简称RK大鼠），分别于术前及术后第1、2、4、6、8和12周处死大鼠。不同时机给予RK大鼠PHD抑制剂L-mimosine（L-Mim）治疗：早期治疗组，治疗时间为术后第2周至第12周；进展期治疗组，治疗时间为术后第4周至第12周；晚期治疗组，治疗时间为术后第8周至第12周。结果生理情况下PHD2和PHD3在肾脏内均有一定程度的表达。PHD2和PHD3在肾切除术后表达逐渐增加，至术后第6周PHD2达到峰值，此后表达明显减少，至12周时降为基线水平；至第4周PHD3达到峰值，此后维持较高水平。与对照组相比，早期治疗组的肾功能障碍加重；进展期治疗组的肾功能障碍有所改善；晚期治疗组与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，早期治疗组低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白表达升高（P＜0.05），而进展期和晚期治疗组与对照组HIF-1α蛋白表达的差异无统计学意义（P＞0.05）。相反，早期治疗组HIF-2α蛋白表达高于对照组（P＜0.05），进展期治疗组HIF-2α蛋白表达则明显高于对照组（P＜0.01），而晚期治疗组HIF-2α蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论PHD2和PHD3在RK进展过程中呈差异性表达；在RK病程进展的不同阶段给予PHD抑制剂L-Mim治疗可以对大鼠肾功能产生有利或有害作用，这可能与PHD抑制剂选择性地活化HIF-α亚型有关。

脯氨酸羟化酶（PHD）； 低氧诱导因子α（HIF-α）； 肾切除； SD大鼠

脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase domain enzyme，PHD）是在蛋白水平调节低氧诱导因子α（hypoxia-inducible factor-α，HIF-α）表达的关键酶，它通过催化HIF-α氧依赖性降解区域中的2个脯氨酸残基的羟基化实现对HIF-α蛋白表达的调控[1-2]。HIF是调节细胞适应低氧环境的重要核转录因子，HIF-α高表达对包括急性肾损伤和慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）在内的多种脏器的缺血缺氧性疾病可能有较好的治疗作用。PHD抑制剂是实现HIF高表达的有效药物。虽然动物研究证实PHD抑制剂对急性肾损伤有治疗作用，但其对CKD的治疗作用仍存在争议[3-8]。本研究以5/6肾切除大鼠（以下简称RK大鼠）作为CKD动物模型，选用PHD抑制剂L-mimosine（LMim）作为活化HIF-α的药物，动态观察PHD在RK大鼠病程中的表达变化及在病程不同阶段进行的PHD抑制剂治疗，明确PHD抑制剂治疗对CKD进展的作用，并探讨其可能的作用机制。

材料和方法

实验材料清洁级SD雄性大鼠，体重180～200 g，购于复旦大学上海医学院实验动物中心。兔抗大鼠PHD2和PHD3多克隆抗体（美国Novus公司），兔抗大鼠HIF-1α和HIF-2α多克隆抗体（美国Abcam公司），大鼠微量白蛋白ELISA试剂盒（美国Kamiya公司），核蛋白抽提试剂盒（美国Active Motif公司），引物合成（上海生工），Trizol试剂（美国TEL-TESTInt公司），ECL显色系统（美国Pierce公司）。

实验动物模型制作4%戊巴比妥钠麻醉（40 mg/kg，ip）和消毒后，无菌条件下切除左肾上、下极各1/3肾组织，1周后麻醉下摘除右肾，2次手术共摘除5/6个肾脏。选取2次手术后存活的大鼠进行以下研究。

实验设计与分组研究分两阶段进行。阶段1：明确PHD2和PHD3在健康大鼠肾脏内的生理性表达和在RK大鼠肾脏内的病理性表达。处死假手术的大鼠3只（sham）；其余大鼠行5/6肾切除后随机分为6组（n=6），分别于第1、2、4、6、8和12周末处死，留取血、尿和肾组织标本。阶段2：在RK大鼠病程的不同阶段采用L-Mim（美国Calbiochem公司）活化HIF，明确PHD抑制剂治疗对CKD的作用。不同阶段的确立基于我们以往关于HIF-1α和HIF-2α在RK大鼠病程中的动态表达的研究[9]。RK大鼠随机分为4组（n=5）：未治疗的对照组（RK）；早期 L-Mim 治疗组（RK+LM2-12），L-Mim治疗时间为肾切除术后第2至12周；（3）进展期LMim治疗组（RK+LM4-12），L-Mim治疗时间为肾切除术后第4至12周；（4）晚期L-Mim治疗组（RK+LM8-12），L-Mim治疗时间为肾切除术后第8至12周。在疗程结束的第12周末处死大鼠。L-Mim治疗方案：50 mg/kg隔日腹腔注射。

生化指标测定收集各组大鼠处死前24 h的尿液，ELISA法测定24 h尿微量白蛋白（24 h Ualb）。处死时心脏穿刺采血，分离血清，采用全自动生化分析仪测定血清肌酐（serum oreatinine，Scr）浓度和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）浓度。

肾脏病理检查取部分肾组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度2μm，分别行PAS染色和免疫组化染色，观察肾小球硬化、肾间质纤维化和肾间质炎症细胞浸润情况。

免疫组化染色采用Envision二步法检测PHD2和PHD3的表达，细胞深棕色染色为阳性。半定量评分标准：200倍光镜下，每张切片在肾皮质部位随机选取20个不重叠的视野，分析各视野下阳性面积百分比，计0～5分[3]。

Western hlot检测蛋白质抽提残肾皮质核蛋白待测HIF-1α和HIF-2α，抽提残肾皮质总蛋白待测PHD2和PHD3，BCA法进行蛋白质定量。每泳道上样50μg蛋白，10%SDS-PAGE电泳分离后湿转至PVDF膜，封闭，加Ⅰ抗杂交，4℃冰箱过夜，洗膜，再加相应Ⅱ抗室温孵育，最后用增强化学发光系统显色，用图像分析系统进行灰度扫描。

RT-PCR检测RNA取残肾皮质100mg，按说明书用Trizol试剂提取总RNA，逆转录后进行PCR。PHD2 引物：上游 5＇-CTGGGACGCCAAGGTGA-3＇，下 游 5＇-CAATGTCAGCAAACTGG-3＇，退火温度58℃。PHD3引物：上游5＇-GTTCAGCCCTCCTATGC-3＇，下 游 5＇-ACCACCGTCAGTCTTTA-3＇，退火温度57℃。β-Actin引物：上游 5＇-CTTTCTACAATGAGCTGCGTG-3＇，下 游5＇-TCATGAGGTAGTCTGTCAGG-3＇，退火温度60℃。PCR反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，退火45 s，72℃延伸45 s，反应30个循环，后72℃延伸10 min。取PCR产物1μg，1.2%琼脂糖电泳，用生物电泳图像分析系统（复日科技，FR-200）进行分析，以待检测指标与β-actin吸光度（D）的比值来表示其相对含量。

统计学处理数据采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间比较采用Bonferroni法。使用Stata 10.0医学统计软件进行数据分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

PHD2和PHD3在大鼠肾脏内的生理性表达生理情况下PHD2和PHD3在肾脏内均有一定量的表达，半定量评分结果：PHD2在皮质为1.2±0.3，在髓质为1.4±0.4；PHD3在皮质为2.1±0.4，在髓质为1.9±0.3。PHD2和PHD3均主要位于皮质远端小管和髓质集合管；不同的是，PHD2位于胞质，而PHD3在胞质和胞核均存在（图1）。

图1 PHD2和PHD3在大鼠肾脏中的生理性表达Fig 1 The physiologic expressions of PHD2 and PHD3 in renal kidneyA：PHD2 expression in cortex；B：PHD2 expression in medulla；C：PHD3 expression in cortex；D：PHD3 expression in medulla；E：PHD2 was expressed only in cytoplasm；F：PHD3 was expressed both in cytoplasm and nucleus （IHC，A-D：×200，E-F：×400）.Red arrows：Positive staining of PHD2 and PHD3 in the kidney.

5/6肾切除大鼠肾功能和病理变化肾切除后第1周RK大鼠出现了短暂的急性肾衰竭，之后Scr下降并进入稳定的慢性肾衰竭阶段，较多肾小管增生和代偿性肥大，部分小管上皮细胞萎缩、管腔扩张，间质少量炎症细胞浸润；第6周后Scr进行性升高，小管间质损伤加重；第8至12周时大量小管结构消失，残存小管代偿性扩张，间质大量纤维化、炎症细胞浸润[9]。

PHD2和PHD3在5/6肾切除大鼠肾病进展中的表达为研究RK大鼠病程不同阶段PHD2和PHD3的表达变化，我们首先对肾切除术后第1、2、4、6、8、12周的肾皮质进行免疫组化染色。结果发现，PHD2在肾切除术后表达逐渐增加，至术后第6周时达到峰值，此后表达明显减少，第12周时降至基线水平；PHD3在肾切除后表达亦逐渐增加，第4周时达到峰值，此后表达逐渐减少但仍维持较高水平（图2）。对上述不同时间点的肾皮质进行Western blot检测和RT-PCR检测也证实了上述结果（图3）。由此可见，RK大鼠肾脏皮质PHD2和PHD3的表达较健康大鼠有不同程度的增加，且以PHD3表达为主。

不同时机L-Mim治疗对5/6肾切除大鼠肾病进展的作用各组RK大鼠在体重和收缩压方面的差异无统计学意义（P＞0.05）。与未治疗的RK组相比，RK+LM2-12组的Scr和24 h Ualb均增加（P＜0.01），而BUN和血红蛋白（hemoglobin，Hb）的差异无统计学意义（P＞0.05）；RK+LM4-12组的BUN、Scr降低和24 h Ualb（P＜0.01），Hb增加（P＜0.05）；RK+LM8-12组的BUN、Scr、24 h Ualb和 Hb与RK组相比差异均无统计学意义（P＞0.05，表1）。

RK+LM2-12组的肾小球硬化指数和小管间质损伤指数均高于RK组（P＜0.05），RK+LM4-12组的上述指数均低于RK组（P＜0.01），RK+LM8-12组与RK组相比差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

不同时机L-Mim治疗对5/6肾切除大鼠HIF-α的选择性活化12周末各组PK大鼠残肾皮质HIF-1α和HIF-2α蛋白表达的 Western blot测定结果见图5。RK+LM2-12组的HIF-1α蛋白表达高于RK组（P＜0.05），而 RK+LM4-12组和 RK+LM8-12组的HIF-1α蛋白表达与RK组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。相反，RK+LM2-12组的HIF-2α蛋白表达高于 RK 组（P＜0.05），RK+LM4-12组的HIF-2α蛋白表达显著高于RK组（P＜0.01），RK+LM8-12组的 HIF-2α蛋白表达与RK组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 5/6肾切除后肾组织中PHD2和PHD3的表达变化Fig 2 Expressions of PHD2 and PHD3 in remnant kidneyvs.0 wk group，（1）P＜0.05，（2）P＜0.01.Red arrows：Positive staining of PHD2 and PHD3 in the kidney（IHC，×100）.

图3 不同时间点RK大鼠PHD2和PHD3的m RNA和蛋白水平Fig 3 The mRNA and protein levels of PHD2 and PHD3 in RK rats at different time pointA：RT-PCR test；B：Western blot test.（1）vs.0 wk group，P＜0.05；（2）vs.0 wk group，P＜0.01.

表1 L-Mim治疗时间对RK大鼠生化指标的影响Tah 2 Functional effects of L-Mim administration on RK rats ±s）

表1 L-Mim治疗时间对RK大鼠生化指标的影响Tah 2 Functional effects of L-Mim administration on RK rats ±s）

（1）vs.sham group，P＜0.01；vs.RK group，（2）P＜0.05，（3）P＜0.01.

Remnant kidney groupsSham group（n=4）Biochemical indicatorsRK（n=5）RK+LM2-12（n=6）RK+LM4-12（n=6）RK+LM8-12（n=6）Body weight（g）416±11294±13（1）297±8（1）310±15（1）（2）290±13（1）SBP（mm Hg）98±3147±15（1）146±16（1）142±18（1）149±15（1）BUN （mmol/L）5.1±0.433.4±4.0（1）30.0±2.9（1）16.7±2.7（1）（2）31.4±4.6（1）Scr（μmol/L）23.4±2.8130.0±24.1（1）165.6±10.7（1）（3）82.4±6.3（1）（2）125.2±13.2（1）Hb（g/L）145.0±6.9100.2±7.6（1）97.4±8.0（1）118.6±12.7（1）（2）99.2±6.4（1）24 h Ualb（mg/d）0.3±0.1167.8±49.2（1）292.0±52.2（1）（2）68.6±8.9（1）（2）172.4±23.3（1）

图4 L-Mim治疗时间对RK大鼠肾皮质组织形态学的影响Fig 4 Effects of L-Mim on glomerular and tuhular inJuries in RKA：RK group；B：RK+LM2-12group with early long-term treatment；C：RK+LM4-12group with advanced medium-term treatment；D：RK+LM8-12group with end-stage treatment （A-D：×100，PAS）；E：Glomerulosclerosis；F：Tubulointerstitial injury.（1）P＜0.05；（2）P＜0.01.

图5 L-Mim治疗时间对RK大鼠肾皮质HIF-1α和HIF-2α蛋白表达的影响Fig 5 The effect of L-Mim administration maintained different length of time on the protein expressions of HIF-1αand HIF-2αin the cortex of RK ratsWestern blot test.vs.RK group，（1）P＜0.05，（2）P＜0.01.

讨 论

虽然氧浓度和PHD是调控HIF表达的关键因素，但PHD家族存在PHD1、PHD2和PHD3等不同亚型，HIF-α亚基也存在HIF-1α和HIF-2α等不同亚型。在不同的病理生理条件下及不同的脏器组织中，不同的PHD亚型对不同的HIF-α亚型的调节作用强度不同[1-2，10]；作为转录因子，不同的HIF-α亚型也调控着作用不同甚至相反的下游因子的转录[1]。因此，采用PHD抑制剂促进HIF高表达治疗缺血缺氧性肾脏病这一方法变得复杂化。

目前发现在包括肾脏在内的多种组织中，只有PHD2和PHD3受低氧调控明显[2]，因此本研究仅测定PHD2和PHD3在肾脏中的表达。我们发现，生理条件下肾脏髓质集合管和皮质远端小管存在一定量的PHD2和PHD3表达，这与Schödel等[11]的研究结果类似。由于肾脏髓质在生理情况下血氧供应较少，皮质远端小管氧耗相对较大。氧供和氧耗的不平衡使得上述部位存在生理性低氧，而PHD2和PHD3也是接受低氧调控的HIF-α的下游基因[1-2]，这可能是肾脏内存在生理性PHD2和PHD3表达的原因。而这种生理性表达所带来的负反馈效应可能是肾脏生理性低氧区域内仍然鲜有HIF-1α和HIF-2α表达的原因之一。

以我们对HIF-α在CKD进展过程中病理性表达变化的既往研究为基础[9]，本研究以RK大鼠作为CKD动物模型，在HIF-α活化的不同阶段分别给予PHD抑制剂L-Mim持续干预治疗。结果发现，采用L-Mim活化HIF对RK病程进展起着“两面性”的作用，既有保护性作用，也可能出现不良结果，这取决于药物干预的时间：在肾切除早期立即给予持续L-Mim治疗直至疾病终末期将加快肾功能恶化的进程；在疾病进展期给予持续L-Mim治疗则可延缓病程进展；晚期基于持续L-Mim治疗已无法逆转肾损伤。

PHD属于2-酮戊二酸依赖的二氧酶家族，其特征是对Fe2+的绝对需求以及将2-酮戊二酸和分子氧作为协同底物[12]。HIF-α活化的经典药物钴在广义上也是一种PHD抑制剂，它通过螯合Fe2+抑制PHD，从而达到模拟低氧的效果。而L-Mim、DMOG以及3，4-DHB等PHD抑制剂则作为2-酮戊二酸类似物竞争性地抑制PHD活性。因此，理论上讲，包括L-Mim在内的上述药物均是非选择性的PHD抑制剂，它们可以同等程度地活化所有HIF-α亚型。但研究结果并非如此。早期有关钴对CKD作用的研究发现钴的肾脏保护作用与HIF-1α活化有关，但未研究其与HIF-2α的关系[3，5]。而近期在糖尿病肾病大鼠中发现钴可以同步上调肾脏内HIF-1α和HIF-2α表达[6]。但是，对于正常肾脏和急性缺血后的肾脏，采用包括L-Mim在内的非选择PHD抑制剂可以更多地活化HIF-1α，而较少活化HIF-2α[13-14]。本研究发现，早期给予RK大鼠持续L-Mim治疗以活化HIF-1α为主，对HIF-2α的作用不明显，而在疾病进展期给予持续L-Mim治疗则选择性地活化了HIF-2α，对HIF-1α无显著影响。由此可见，在不同的病理生理条件下，非选择性PHD抑制剂可以选择性地活化肾脏内的HIF-1α和HIF-2α。

关于非选择性的PHD抑制剂可以选择性地活化HIF-α亚型的机制目前仍然不明确。不同PHD亚型对不同HIF-α亚型的羟基化作用强度不同，如PHD2对 HIF-1α的羟基化作用强于 HIF-2α，而PHD3对HIF-2α的羟基化作用强于HIF-1α[10]；在不同的病理生理条件下及不同的组织脏器中，PHD亚型的分布强弱也不同。因此，非选择性PHD抑制剂可以选择性地活化HIF-α亚型。在本研究中我们发现，在RK病程进展期PHD3表达较健康大鼠明显增加且明显高于PHD2，这可能是进展期LMim治疗选择性地活化了HIF-2α的原因之一。

目前已明确的HIF下游基因已达100余种，但在特定的情况下、特定的组织细胞内，仅有部分基因可以被转录，而且HIF-1α和HIF-2α对这些基因的转录能力不全相同[1]，如具有抗凋亡和募集内皮祖细胞等功能的EPO是明确的HIF-2α的下游基因；而与纤维化相关的CTGF是明确的HIF-1α的下游基因，HIF-1α基因敲除后的UUO小鼠肾脏内纤维化程度明显减轻[7]。由此我们推测，在本研究中进展期L-Mim治疗可能通过促进HIF-2α的活化来上调EPO等保护性下游基因的转录，从而延缓病程进展；而早期持续L-Mim治疗可能促进了HIF-1α的持续活化使得CTGF等与纤维化相关的基因转录增加，从而恶化了肾功能。

本研究结果提示，在RK大鼠病程进展的不同阶段给予PHD抑制剂L-Mim治疗可以对肾功能产生“两面性”的作用，即治疗时机恰当可以有效延缓病情进展，而治疗不当则加快肾功能恶化。这可能与PHD2和PHD3在不同时机的差异性表达使得PHD抑制剂选择性活化了不同HIF-α亚型有关。因此，选择PHD抑制剂治疗CKD需要考虑治疗时机以及被活化的HIF-α亚型。

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Expression of prolyl hydroxylase domain enzyme（PHD）in rat kidney and the effect of PHD inhihitor on rats with 5/6 remnant kidney

YU Xiao-fang，CAI Jie-ru，CUI Meng，LIU Shao-peng，FANG Yi，ZOU Jian-zhou，DING Xiao-qiang△
（Department of Nephrology，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai200032，China）

prolyl hydroxylase domain enzyme（PHD）； hypoxia-inducible factor-α（HIF-α）；remnant kidney； SD rat

special administration of PHD inhibitor L-mimosine（L-Mim）as follows：early longterm L-Mim treatment group were administered at weeks 2-12；advanced medium-term L-Mimtreatment group were administered at weeks 4-12，and end-stage L-Mim treatment group were administered at weeks 8-12.ResultsModerate amount of PHD2 and PHD3 were physiologically expressed in distal tubules of the cortex and tubules of the medulla.PHD2 and PHD3 expressions were gradually increased during the early stage after nephrectomy.PHD2 level peaked at week 6，and then gradually decreased until the baseline at week 12.PHD3 level peaked at week 4，and then maintained at a high level.Compared with control group，renal dysfunction was exacerbated by early long-term L-Mim treatment，and improved by advanced medium-term L-Mim treament.End-stage L-Mim treatment had no effect on RK rats.Compared with control group，early long-time L-Mim treatment up-regulated hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）level（P＜0.05），while advanced medium-term and end-stage LMim treatment had no effect on HIF-1αexpression.Campared with control group，early long-term LMim treatment up-regulated HIF-2αlevel（P＜0.05），and advanced medium-term L-Mim treatment also up-regulated HIF-2αlevel significantly（P＜0.01），while end-stage L-Mim treatment had no effect on HIF-2αexpression.ConclusionsThe expression of PHD2 and PHD3 were different during the progression of RK.PHD inhibitor L-Mim has dual roles in the development of CKD depending on the timing of the administration and possibly the activated isoform of HIF-α.

2013-04-26；编辑：段佳）

上海市科委基础研究重大项目（12DJ1400200）；国家自然科学基金（81000307，81100524）

△Corresponding author E-mail：ding.xiaoqiang@zs-hospital.sh.cn

R 692

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.02.009

*This work was supported hy the MaJor ProJect of Basic Research of Technology Committee in Shanghai of China（12DJ1400200）and the National Natural Science Foundation of China（81000307，81100524）

【Ahstract】 OhJectiveTo characterize prolyl hydroxylase domain enzyme （PHD）expression in physiologic state and during the development of chronic kidney disease（CKD），and to investigate the effect of PHD inhibitor on CKD.MethodsRats with remnant kidney（RK rats）were sacrificed at week 0，1，2，4，6，8，12 after subtotal nephrectomy.An additional group of RK rats were randomized and each