宋海，吴冬青，安红钢，林敏，任雪峰，*

（1.河西学院化学化工学院，甘肃张掖734000；2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃张掖734000）

茵陈（Artemisia Capillaris Herba）为菊科植物滨蒿（Artemisia scoparia Waldst.et Kit.）或茵陈蒿（Artemisia capillaris Thunb.）的干燥地上部分[1]，又名白蒿、绒蒿、松毛艾、猪毛蒿等。其化学成分主要包括有机酸类、香豆素类、色原酮类[2]及挥发油[3]等。茵陈是一种常用的中药，其味辛、苦，性微寒，归脾、胃、肝、胆经，具有清湿热、退黄疸、改善肝功能，提高谷草转氨酶（GOT）、谷-丙转氨酶（GPT）等水平作用的功效，临床上主要用于黄疸尿少，湿疮瘙痒和传染性黄疸型肝炎的治疗[1]。试验以茵陈总黄酮的提取率为考察指标，以分光光度法对其进行测定，优选茵陈总黄酮的最佳提取工艺，以其为茵陈总黄酮提取的生产工艺提供参考。

1 原料、试剂与方法

1.1 原料及处理方法

茵陈：2011年3月采自张掖市甘州区大满镇马均村东部沙漠边缘。

原料处理方法：将茵陈经自来水、蒸馏水洗净后晾干，放入烘箱（50℃）烘干至恒重，粉碎后过60目筛，备用。

1.2 主要试剂

芦丁：（Rutin）国药集团化学制剂有限责任公司（上海），批号：F20040304。95%乙醇，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠等试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

1.3 主要仪器

WFJ2100型可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；KH-300DE型数控超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪：上海青浦沪西仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；GB204电子天平、Pipet-One移液器（100 μL～1 000 μL）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 茵陈总黄酮提取液的制备

精确称取0.500 0 g茵陈干粉于100 mL的圆底烧瓶中，以一定浓度和一定体积的乙醇作溶剂，在一定的提取温度和时间下回流提取，过滤。提取3次后，收集滤液，定容至100 mL的容量瓶中，待测。

1.4.2 单因素试验

分别以提取温度、乙醇浓度、提取时间和料液比为影响因素，设置各因素的不同水平，以确定相关因素对茵陈提取液中总黄酮提取率的影响。

1.4.3 响应面试验

为了获得最佳的工艺条件，根据中心组合设计原理，结合响应面分析法，综合单因素试验结果以料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间4个因素为自变量，茵陈总黄酮提取率为响应值，设计四因素三水平的响应面试验，利用响应面的试验结果，确定茵陈中总黄酮的最佳提取工艺条件。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 Factors and levels code of response surface

1.4.4 芦丁标准曲线的绘制

1.4.4.1 芦丁标准溶液的配制

准确称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品0.0500g，用75%乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中，摇匀。得浓度为0.500 0（mg/mL）芦丁标准溶液。

1.4.4.2 标准曲线的绘制

准确移取浓度为0.500 0 mg/mL芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL，分别置于 10mL具塞试管中，加入5%NaNO2溶液0.50 mL，摇匀，放置6 min后；加入10%Al（NO3）3溶液0.50 mL，摇匀，再放置6 min；然后加4%NaOH溶液5.00 mL，用75%乙醇定容，摇匀，放置10 min后，在510 nm处测定吸光度（以试剂空白为参比），以芦丁体积（V）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线。

1.4.5 茵陈总黄酮提取率的测定

以芦丁试剂空白为参比，依1.4.4.2方法测定吸光度值，总黄酮提取率按下式计算：

2 结果与分析

2.1 标准曲线

按照1.4.4.2的实验方法，以样品体积V（mL）为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

由图1可知，芦丁体积在0.00～3.00 mL范围内芦丁标准溶液浓度与吸光度之间有较好的线性相关性，回归直线方程：A=0.002 07+0.618 6V，R2=0.999 54。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取温度对黄酮提取率的影响

精确称取0.500 0 g茵陈干粉，固定乙醇浓度为50%，提取时间为 2 h，料液比为 1 ∶50（g/mL），考察提取温度在 30、40、50、60、70、80、90 ℃范围内对茵陈总黄酮提取率的影响，见图2。

图2 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of extract temperature on extraction yield of total flavonoids

从图2可以看出，随着温度的升高，吸光度不断增加，但当温度达到70℃后，吸光度开始减小，一直呈下降趋势，这是因为温度升高，分子运动速度加快,渗透、扩散、溶解速度加快，黄酮类化合物更易从细胞中转移到溶剂中，使黄酮类化合物的得率随提取温度的升高而提高，当温度升高到一定程度时,黄酮类化合物被氧化破坏而导致其得率下降[4-5]。因此，选择提取温度为70℃。

2.2.2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

精确称取0.500 0 g茵陈干粉，固定提取温度为70 ℃，提取时间为 2 h，料液比为 1∶50（g/mL），考察乙醇浓度在 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%的范围内对茵陈总黄酮提取率的影响，见图3。

图3 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

从图3可以看出，随着乙醇浓度的增加，吸光度不断增加，乙醇浓度在70%时的吸光度最大，随后逐渐减小。这可能由于茵陈中黄酮类化合物多为水溶性和醇溶性物质，具有较强的极性，根据相似相溶原理，在乙醇浓度为70%时，醇溶性和水溶性的黄酮类物质都能最大程度的溶出，而乙醇浓度超过70%时，水溶性黄酮溶出量大幅度减少故黄酮提取率下降。所以在乙醇浓度为70%时其吸光度达到最大，故选择乙醇浓度为70%。

2.2.3 料液比对黄酮提取率的影响

精确称取0.500 0 g茵陈干粉，固定提取温度为70℃，提取时间为2h，乙醇浓度为70%，考察料液比在 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70和 1∶80的范围内对茵陈总黄酮提取率的影响，见图4。

由图4可知，在料液比为1∶60时，总黄酮的提取率达到最大，可能原因是在1∶60之前随着溶剂和溶质的接触面积慢慢增大，茵陈总黄酮的提取量也增大，在1∶60之后，由于溶剂过多，溶剂和溶质的接触面积慢慢减小，随之提取量也减小，因此，选择料液比为 1∶60。

2.2.4 提取时间对黄酮提取率的影响

图4 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

精确称取0.500 0 g茵陈干粉，固定提取温度为70℃，乙醇浓度为70%，料液比为1∶60，考察提取时间在 0.25、0.5、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5 h 的范围内对茵陈总黄酮提取率的影响，结果如图5所示。

图5 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of extract time on extraction yield of total flavonoids

由图5可知，随着提取时间增加，总黄酮的提取率不断增加，在1 h时达到最大值，之后增幅逐渐较小。从提取效果和时间效益考虑，选择最佳提取时间为1 h。

2.3 响应面试验

以料液比、乙醇浓度、提取时间和提取温度为自变量，茵陈总黄酮提取率为响应值（Y），进行响应面分析试验。试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experimental design and results

续表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experimental design and results

采用Design-expert 7.1.6软件对表2中数据进行多项拟合回归，建立多元二次响应面回归模型：

2.3.1 方差分析

各因素的方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果Table 3 Variance analysis of extraction rate of total flavonoids of Artemisia Capillaris Herba

由表3知，模型的“Prob＞F”值小于 0.000 1，表明二次方程拟合极其显著，失拟项F值为3.42，表明失拟项相对于绝对误差是不显著的，而不显著的失拟项才可用。提取时间（X3）的“Prob＞F”值小于 0.000 1，表明其对茵陈总黄酮提取率影响及其显著，料液比（X1）、乙醇浓度（X2）和提取温度（X4）的“Prob＞F”值小于0.01，表明其对茵陈总黄酮提取率影响较为显著。决定系数R2=0.938 2，CV值为2.81%，说明模型拟合好，实验误差小，实验操作可信，可用此模型对茵陈总黄酮提取率进行分析和预测[6-7]，且影响茵陈总黄酮提取率的各因素按影响大小排序依次为提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度。二次项 X12、X22、X32和 X42影响极显著，其它不太显著，表明各因素对总黄酮提取率不是简单线性关系。各交互因素响应曲面图如图6，可以看出同样的结果。

2.3.2 验证试验

图6 各因素对茵陈中总黄酮提取率影响的三维响应曲面图Fig.6 Response surface for the effects of variables on the rate of the total flavonoids from Artemisia Capillaris Herba

通过回归模型预测的茵陈总黄酮提取最佳工艺条件为料液比1∶72.9，乙醇浓度为76.6%，提取时间为1.685 h，提取温度为73.5℃，在此条件下，茵陈总黄酮提取率理论上可达7.962%。考虑到实际操作的可行性，将茵陈总黄酮的最佳提取条件在理论值基础上修正为料液比为1∶73，乙醇浓度为77%，提取时间为1.68 h（100 min），提取温度为 71℃，采用此工艺条件进行验证实验，平行3组。测得的茵陈总黄酮提取率分别为7.893%、7.935%和7.932%，茵陈总黄酮提取率的平均值为7.920%，相对误差为0.53%，说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，具有一定的实际价值。

3 结论

响应面分析法是研究几种因素间交互作用的回归分析方法，它克服了正交设计只能处理离散的水平值，而无法找出整个区域上因素的最佳组合和相应值的最优值的缺陷[8]。采用响应曲面分析中的Box-Behnken模式，对茵陈总黄酮提取工艺条件进行了优化，并得出最佳工艺参数。试验结果表明，模型拟合程度高，试验误差小，可用于实际预测。优化的工艺条件为：料液比1∶73，乙醇浓度为77%，提取时间为1.68 h，提取温度为71℃，在此条件下，茵陈总黄酮理论提取率为7.962%，实际得率为7.962%，优化得到的预测结果与实际结果吻合较好。说明采用响应面法优化得到的茵陈总黄酮提取工艺准确。

[1]国家药典委员会.中国药典 (一部)[M].北京:化学工业出版社,2005:166

[2]王春梅,胡坪,刘清飞,等.指纹图谱技术在茵陈提取工艺优化中的应用[J].中成药,2007,29(6):785-787

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[5]张延杰,田金河.绿豆壳中提取黄酮的工艺研究[J].粮油食品科学,2005,13(5):39-40

[6]张国华,乔建卫,张如松.响应面法优化超声提取行白菊黄酮工艺条件的研究[J].亚太传统医药,2009,5(2):20-22

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