齐育平，孙 蕾，刘琴英，蒋冬花

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是指一类能够通过同型发酵或异型发酵而产生乳酸的细菌［1］。大多数乳酸菌是有着重要经济价值的食品级微生物［2］。谷氨酸脱羧酶［3］(Glutamate decarboxylase，EC 4.1.1.15，简称GAD)在动物、植物和微生物中广泛存在，催化谷氨酸的α-脱羧反应，生成γ-氨基丁酸(GABA)，是GABA唯一的合成酶［4］，对维持整个GABA能系统稳定地运转起着至关重要的作用。乳酸菌是一种优良、高产、安全的菌种，利用乳酸菌生产GABA已经成为一种较为理想的生物合成方法。目前已有多种乳酸菌的谷氨酸脱羧酶基因被克隆［5-8］。生物信息学(bioinformatics)是一门利用应用数学、信息学、统计学和计算机科学的方法研究生物学问题的学科。生物信息学的研究工具是计算机，研究方法包括对生物学数据的搜索(收集和筛选)、处理(编辑、整理、管理和显示)及利用(计算、模拟)。目前主要的研究方向有序列比对、基因识别、基因重组、蛋白质结构预测、基因表达、蛋白质反应的预测以及建立进化模型。本文以1株高产GABA的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)Lb-2菌株［9］为研究对象，克隆了其GAD基因，并利用生物信息学方法预测分析了其氨基酸组成、理化性质、信号肽及其高级结构等，以期指导分析该菌株的高产GABA特性、后续目的基因的表达纯化以及研究该酶的生物学特性等。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 短乳杆菌(Lactobacillus brevis)Lb-2菌株为本实验室筛选保存的1株高产γ-氨基丁酸(GABA)的菌株。

1.1.2 培养基 改良的MRS培养基(g):蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物5，葡萄糖5，乙酸钠2，柠檬酸二胺2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 L，pH 6.50。

1.1.3 主要数据库及软件 NCBI blast:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/、ExPASy:http://www.expasy.org/、SignalP:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/、GOR Ⅰ:http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor.html、PSORT WWW Server:http://psort.hgc.jp/、SWISS-MODEL:http://swissmodel.expasy.org/;LaserGene、MEGA4、DNAMAN。

1.2 方法

1.2.1 GAD基因克隆 以本实验室分离得到的短乳杆菌Lb-2菌株cDNA为模板，参照已发表的短乳杆菌GAD核苷酸序列设计引物，上游引物Forward:5'-ATG TTA CAC AGG CAC GGT TCT AAG CAG AAG-3';下游引物Reverse:5'-TCA ACA TGT TCC TCT ATA GTT TCT C-3')进行PCR扩增，引物由上海生工公司合成。

1.2.2 GAD基因氨基酸序列及保守结构域 利用综合性序列工具软件LaserGene中的ORF Finder确定其完整的编码序列(complete coding sequence，CDS)，然后保存为Translation Sequence格式，输出其氨基酸序列。利用NCBI的Conserved Domains检测该序列的保守结构域。

1.2.3 ProtParam预测GAD的理化性质 用Ex-PASy［9］的ProtParam［10］工具对GAD氨基酸序列进行分析，如分子量、等电点、氨基酸组成、摩尔消光系数、半衰期、稳定性等。

1.2.4 GAD 的基本信息分析 Motifscan［11］预测一级结构中糖基化、脂酰化、磷酸化、硫酸化、GPI锚着位点等修饰位点和模序;用SignalP 4.1［12］在线进行信号肽预测;用PSORT WWW Server中的PSORT Prediction工具进行细胞定位;用ExPASy的ProtScale进行在线蛋白质疏水性分析。

1.2.5 GAD 二级结构预测 多肽链的螺旋和折叠使氨基酸形成稳定的空间结构，从而使蛋白具有特定理化性质和生物学活性，利用GORⅠ完成蛋白质的二级结构预测。

1.2.6 GAD 三级结构同源建模 SWISS-MODEL［13-14］是一种使用同源建模方法来预测蛋白质三维结构的工具，利用Automated Mode将GAD与蛋白结构数据库中的蛋白质三维结构进行匹配，预测GAD的三级结构模型。

1.2.7 系统进化树的构建 通过构建系统进化树可以比较不同物种间的进化距离，进而判断它们的亲缘关系。检索GenBank中已公布的GAD氨基酸序列，使用MEGA4［15］软件进行对比分析并构建系统树［15］。

1.2.8 多序列比对 利用DNAMAN软件将获得的GAD氨基酸序列与NCBI里已公布的4种短乳杆菌GAD氨基酸进行多重序列比对，分析所克隆到的GAD与其他短乳杆菌菌株GAD的异同。另4种分别为短乳杆菌877G菌株(Lb-877G，登录号:AFU61547.1)、短乳杆菌 BH2菌株(Lb-BH2，登录号:ABU55419.1)，短乳杆菌CGMCC 1306菌株(Lb-CGMCC 1306，登录号:ADG02973.1)和短乳杆菌ATCC 367菌株(Lb-ATCC 367，登录号:YP_795941.1)。

2 结果与分析

2.1 GAD 基因的克隆

本实验以短乳杆菌(图1)cDNA为模板经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析获得一长度为1 407 bp的PCR产物(图2)。

图1 短乳杆菌Lb-2显微形态Fig.1 The morphology of Lb-2

图2 PCR产物电泳图Fig.2 The electrophoresis of PCR products

2.2 GAD 基因的氨基酸序列

将上述片段回收、测序，最终得到一条全长为1 407 bp的序列(图3)，经软件分析，该序列为一个完整的阅读框，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码468个氨基酸。将该序列进行Blast检索，发现其与短乳杆菌877G菌株的GAD基因(登录号:JX545343.1)相似性为99%，与短乳杆菌BH2菌株的GAD基因(登录号:EU084998.1)相似性为98%，推测该序列为短乳杆菌GAD基因序列。将此氨基酸序列提交到Conserved Domains检测保守结构域，结果显示(图4)，该序列的保守结构域类似多巴脱羧酶家族，该家族主要包括酪氨酸脱羧酶、组氨酸脱羧酶和谷氨酸脱羧酶。

2.3 短乳杆菌GAD氨基酸序列的理化性质

短乳杆菌GAD共有468个氨基酸(表1)，65个带负电氨基酸残基，46个带正电荷氨基酸残基，亮氨酸(Leu)所占比重最高，为9.2%;理论分子量和等电点(PI)分别为53 517.8 u和5.42，分子式为C2412H3675N637O703S21;含有6个半胱氨酸，假设形成3对二硫键，则该蛋白在水溶液中280 nm处的摩尔消光系数为87 125 M－1cm－1;蛋白浓度为l g/L时，半胱氨酸未形成二硫键吸光系数(Abs)为1.621。当成熟肽氨基端的第一个氨基酸为甲硫氨酸(Met)时，GAD在哺乳动物网状红细胞体外表达的半衰期为30 h，在酵母和大肠埃希菌中体内表达的半衰期分别大于20 h和10 h。在溶液中的不稳定指数为27.11，低于阈值40，表明在溶液中性质稳定。脂溶指数为85.04，疏水指数为－0.297，初步判断该蛋白是亲水性蛋白。

2.4 短乳杆菌GAD的信息分析结果

GAD翻译后的修饰位点分析结果显示:GAD含有3个潜在的N-糖基化位点;3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;5个潜在的N-肉豆蔻酰位点;4个潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点;2个酪氨酸激酶磷酸化位点;1个组氨酸脱羧酶活化位点，位于38～428位氨基酸;1个L-酪氨酸脱羧酶活化位点，位于45～445位氨基酸。

PSORT Prediction预测该蛋白位于细胞质。TMHMM Server 2.0预测其没有跨膜区域。SignalP 4.1 Server预测结果显示该蛋白不含信号肽，可以推断GAD在细胞质中合成后，不进行蛋白转运;TargetP结果未发现线粒体、过氧化物酶体、溶酶体和细胞核等亚细胞定位序列。

表1 短乳杆菌GAD的氨基酸组成Table1 The amino acid composition of GAD of Lb-2

图3 短乳杆菌Lb-2的GAD基因及氨基酸序列Fig.3 The gene and amino acid sequence of GAD of Lb-2

图4 短乳杆菌Lb-2的GAD的保守结构域Fig.4 The conserved domains of GAD of Lb-2

ExPASy的ProtScale在线预测，疏水性氨基酸为正值，亲水性氨基酸则为负值，氨基酸的绝对值越高则表明亲疏水性越强。图5显示该GAD疏水性最小值约为－2.589，最大值约为2.544，整个多肽链中分值较低的氨基酸占多数，即亲水性氨基酸比例高于疏水性氨基酸，因此推断该蛋白为亲水性蛋白，与ProtParam预测结果一致。

图5 短乳杆菌Lb-2的GAD氨基酸序列亲水性分析Fig.5 The hydrophilicity analysis of the amino acid sequence of GAD from Lb-2

2.5 二级结构分析

蛋白质二级结构预测方法有SOPM、SOPMA、HNN、PHD和GOR等，其中GOR方法将蛋白质序列当作一连串的信息值来处理，不仅考虑了被预测位置本身氨基酸种类的影响，而且考虑了相邻氨基种类对该位置构象的影响，预测效果较好。本文利用GORⅠ预测蛋白二级结构，结果显示(图6)，该蛋白二级结构中α-螺旋比例为51.71%，延伸链比例为31.20%，β-转角占8.12%，无规卷曲占8.97%。

图6 GORⅠ预测的短乳杆菌GAD二级结构Fig.6 The predicted secondary structure of GAD by GORⅠ

2.6 三级结构建模

三级结构是由α-螺旋、β-折叠等二级结构再折叠成一个球形的、包裹紧密的立体空间结构，可使一级结构中2个离得较远的氨基酸残基通过折叠使它们的侧链相互靠近，并且通过疏水作用等构成活性位点。采用SwissModel Automatic Modelling Mode预测短乳杆菌Lb-2的GAD三级结构模型，系统自动选取了拟南芥(Arabidopsis thaliana)GAD1基因作为模板，两者序列相似度为40.23%，Evalue值为 0.00e-1，QMEAN Z-Score为－2.54，四级结构信息显示该模型为单链模型，没有配体。模型(图7)显示该GAD蛋白含有大量的α-螺旋和β-折叠，与二级结构的预测结果相符。

2.7 系统进化树的构建

MEGA是一款主要集中于进化分析进而获得综合序列信息的软件，可以编辑序列数据、序列比对、构建系统发育树、推测物种间的进化距离等。在构建进化树时可提供4种方法:最大简约法、邻接法、最小进化法、算术平均的非加权对群法。本文采用MEGA对乳杆菌目中12种菌的GAD氨基酸序列基于邻位相连法构建系统树，结果如图8所示，短乳杆菌GAD与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)亲缘关系最近。

图7 短乳杆菌Lb-2的GAD的三级结构预测Fig.7 The predicted tertiary structure of GAD from Lb-2

2.8 多重序列比对

5种短乳杆菌GAD氨基酸序列多重序列比对结果见图9。从图9中可以看出，5种短乳杆菌GAD氨基酸序列的长度一致，都是467个;短乳杆菌种间的GAD氨基酸序列差异很小，只有个别氨基酸的不同;本文得到的短乳杆菌Lb-2的GAD氨基酸序列在416位上为丙氨酸(A)，与其他序列有差异，但与短乳杆菌BH2菌株相同。

图8 12种乳杆菌GAD的系统进化树Fig.8 The phylogenetic trees of 12 GADs

3 讨论

生物信息学研究的材料是生物学的数据，通过情报学的方法，综合运用数学、计算机科学、情报信息等工具，对生物信息加工后得到相关信息。生物信息学是新兴的学科，是当今国内外研究的热点，在生物技术、生物医学、农业、食品、环境、能源等研究领域发挥了重要作用［16］。

本研究克隆了短乳杆菌GAD基因序列，其全长为1 407 bp，编码468个氨基酸，有酪氨酸脱羧酶结构域，理论分子量和等电点(PI)分别为53 517.8 u和5.42，位于细胞质，为亲水性蛋白，不含信号肽。二级结构预测显示α-螺旋比例为51.71%，延伸链比例为31.20%，β-转角占8.12%，无规卷曲占8.97%，构建系统发育树发现该短乳杆菌GAD基因与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的GAD基因亲缘关系最近。

应用软件预测蛋白的结构和功能有一定的局限性，虽然不可能做到完全正确，但总体上近似。此外，由于在蛋白质性质分析过程中采用的方法不同，也会导致分析结果有差异。因此，本研究基本采用目前生物领域较为认可的信息学分析方法，通过这些生物信息学的分析方法所得到信息有一定的参考价值，有助于更加深入地认识乳杆菌谷氨酸脱羧酶，为研究谷氨酸脱羧酶的表达、分离、纯化提供借鉴。

［1］金世琳.乳酸菌的科学与技术［J］.中国乳品工业，1998，26(2):14-20.

［2］闫肃，吕嘉枥，郜洪涛.乳酸菌在食品工业中的应用［J］.中国酿造，2010，12:1-3

［3］林谦，杨胜远，陆兆新，等.嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶基因及其侧翼区序列分析［J］.食品科学，2011，32(3):121-125.

［4］杜昭，李世峰，李逸平.谷氨酸脱羧酶在神经系统及雄性生殖系统中的功能［J］.生命的化学，2013，33(2):96-100.

［5］Masaru N，Ikuyo N，Yasuhita F，et al.Lactococcus lactiscontains only one glutamate decarboxylase gene［J］.Microbiology，1999，145(6):1375-1380.

［6］Park K B，Oh S H.Cloning，sequencing and expression of a novel glutamate decarboxylase gene from a newly isolated lactic acid bacterium，Lactobacillus brevisOPK-3［J］.Bioresource Technology，2007，98(2):312-319.

［7］Park K B，Heung O S.Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene fromLactobacillus plantarum［J］.Journal of Food Science and Nutrition，2004，9(4):324-329.

［8］Kim S H，Shin B H，Kim Y H，et al.Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene fromLactobacillus brevisBH2［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2007，12(6):707-712.

［9］缪存影，蒋冬花，徐晓波，等.酸菜中高产 γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选和鉴定［J］.微生物学杂志，2010，30(2):28-32.

［10］Elisabeth G，Alexandre G，Christine H，et al.ExPASy:the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis［J］.Nucleic Acids Research，2003，31(13):3784-3788.

［11］Ayan S，Md J A，Muhammad A K U，et al.Computational analysis of bovine alpha-1 collagen sequences［J］.Bioinformation，2013，9(1):42-48.

［12］Shi M，Wang Y N，Zhu N，et al.Four heat shock protein genes of the endoparasitoid wasp，cotesia vestalis，and their transcriptional profiles in relation to developmental stages and temperature［J］.Plos One，2013，8(3):1-10

［13］Petersen T N，Brunak S，Von Heijne G，et al.SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions［J］.Nature Methods，2011，8(10):785-786.

［14］Arnold K，Bordoli L，Kopp J，et al.The SWISS-MODEL Workspace:A web-based environment for protein structure homology modelling［J］.Bioinformatics，2006，22:195-201.

［15］Kiefer F，Arnold K，Künzli M，et al.The SWISS-MODEL Repository and associated resources［J］.Nucleic Acids Research，2009，37:D387-D392.

［16］Koichiro T，Joel D，Masatoshi N，et al.MEGA4:Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0［J］.Molecular biology and evolution，2007，24(8):1596-1599.

［17］孟双，徐冲，陈丽媛，等.生物信息学在生物学研究领域的应用［J］.微生物学杂志，2011，31(1):78-81.