史晓云，刘 静，刘北星*

(1.中国医科大学临床医学7年制96期8班，辽宁沈阳 110001;2.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁沈阳 110001)

2001年，一类区别于T、B、NK细胞的新型细胞群被发现，这类细胞可应答于小鼠体内注射的IL-25进而分泌IL-6、IL-5与IL-13等Th2型细胞因子，它们均依赖于IL-2受体的共同γ链与转录因子Id2(Inhibitor of differentiation2)，并处于分化的终末阶段。这些细胞统称为2型固有淋巴样细胞(Type 2 innate lymphoid cells，ILCs2)［1］。10 a后，多个研究团队同时发现并报道了该细胞群，并根据其生物学作用给予分别命名。迄今为止，ILCs2包括4种细胞:天然辅助细胞(natural helper cell，NHC)、nuocyte、innate helper type cell(Ih2)与multi-potent progenitor type 2 cell(MPPtype2)［2］。其中，NHC是2010年Moro等［3］发现于小鼠腹腔内的脂肪相关淋巴簇(FALC)的2型固有淋巴细胞，由于该种细胞具有辅助B1细胞产生抗体的能力，因此被命名为天然辅助细胞(natural helper cell，NHC)。

1 天然辅助细胞的起源、发育与分化

为探究NH细胞的发生起源，Qi yang等人将RAG-Cre/ROSA 26 YFP小鼠体内的NHC通过流式细胞仪技术分离出来，经过PCR技术分析发现多于50%的NHC为YFP阳性。YFP阳性细胞分为2种，一种为自身表达RAG-1基因，另一种是该种细胞来源于表达RAG-1基因的祖细胞。而成熟的NH细胞并不表达RAG-1基因，由此说明NH细胞的前体细胞表达RAG-1基因。重组激活基因(recombination activating genes，RAGs)是一组具有稳定的能够激活重组反应能力的功能基因，分为RAG-1与RAG-2，RAGs的表达在淋巴系细胞分化发育中起十分重要的作用。由此推断，NHC可能来源于淋巴系祖细胞。表达RAG-1的前体细胞包括:共同淋巴样祖细胞(common lymphoid progenitors，CLPs)与发育更原始的淋巴引物多功能祖细胞(lymphoid-primed multipotent progenitors，LMPPs)。研究者就造血干细胞、CLPs、LMPPs与髄样红系祖细胞分化为NHC的能力进行研究，结果显示:造血干细胞、LMPPs与CLPs均可发育为NH细胞，而髓样红系祖细胞并未分化为NHC。同时，就分化为NHC的能力而言，LMPPs更强于CLPs。

据报道，T、B淋巴细胞的发育依赖于RAG-2基因，而NHC的发育受影响于RAG-1基因，因此，RAG-2基因敲除的小鼠体内无发育成熟的T、B淋巴细胞，而具有成熟的NHC。此外，NHC的发育依赖于IL-2受体的共同γ链，所以进行γc基因敲除的小鼠(γc－/－、gc－/－或IL-2rg－/－)体内无发育成型的NHC。因此，在关于NHC的实验中，一般采用Rag2－/－与γc－/－Rag2－/－鼠作为对照。

Halim等在骨髓中发现了定向分化为天然辅助细胞的祖细胞，并将其命名为iNH cell(immature NH cell)。他们将iNH cell注射到NSG非照射鼠体内，iNH cell在骨髓内大量扩增，继而转移至肠与肺脏等组织中分化为成熟的NH细胞。在iNH cell分化为NHC的过程中，其表型及生物学功能均发生了部分变化。相对于幼鼠体内的iNH cell而言，成熟的NHC表达相对较多的CD69、CXCR4、CD122，而表达少量CD27。此外，以单个细胞为基础，在PMA与离子霉素的共同刺激下，相比于iNH cell，NHC产生更多的Th2型细胞因子。同时，iNH细胞与NHC针对于体外不同细胞因子刺激而做出的应答亦不同［4］。为探究成熟NHC的分化潜能，Moro等将NHC放于诱导T细胞分化的Tst-4/DLL1细胞系中进行培养，结果发现无分化产生的T细胞;再将其与Tst-4细胞一起培养，NHC亦未分化为B细胞;再者，NHC在体内外都无法分化为NK细胞或NK1.1+NK46+细胞［3］。综上所述，NHC已处于分化的终末阶段，无继续分化的潜能。

2 天然辅助细胞的细胞生物学与分子生物学特征

天然辅助细胞最先发现于小鼠腹腔大小肠内的脂肪组织中，其中有一种特殊的淋巴组织结构，即脂肪相关淋巴簇(FALC)。FALC中的免疫细胞与周围脂肪细胞紧密相接，且外周无纤维鞘包裹，而NHC占FALC中所有细胞总数的20%～40%。继FALC NHC发现后，Halim等在幼鼠肺脏中发现了另一种天然辅助细胞，并将其命名为LNH cell(lung natural helper cell)［5］。此外，NHC还存在于肝脏、骨髓以及肾脏与生殖系统周围的内脏脂肪组织中，而在皮下脂肪组织及网膜中未发现此类细胞［2］。

作为一种固有淋巴细胞，天然辅助细胞具有淋巴系细胞的一般形态特征。Giemsa染色结果显示，NHC胞体呈圆形，胞核深染，胞质稀疏。经电子显微技术证实，该种细胞体积较小，具有较高的核质比，胞内高尔基复合体与内质网等细胞器未发育成熟［3］。就表面膜分子的表达状况而言，天然辅助细胞具有其独特性。首先，该种细胞表面无白细胞家族细胞表面标记(lineage)、MHCⅡ与Flt-3。然而，天然辅助细胞表达Thy-1、IL-7R，c-kit、Sca-1、CD25、CD44、CD69、α4β7、ICOS、IL-77RB与T1/ST2等多种膜表面分子［6］。NHC还表达多种转录因子，如:Maf、Gata-3、Jun B、Stat6、Id2、Tbx21。这些转录因子在维持天然辅助细胞的生存及增殖过程中具有不可或缺的作用［7］。

3 天然辅助细胞分泌的细胞因子及其参与的免疫应答

在免疫系统处于稳态时，FALC NHC可持续性产生适量IL-5与IL-6。这两种细胞因子可联合调节B细胞的抗体产生过程。将FALC NHC与脾B细胞共同培养后，B细胞产生并分泌大量IgA抗体，该实验论证了NHC在IgA分泌过程中的关键性辅助作用［3］。IL-5是腹腔内B1细胞赖以生存的决定性生长因子并且在天然抗体介导的固有免疫应答中发挥关键作用［2］。据Moro等报道，重组IL-5可诱导CD23-B1细胞分裂增殖，而对CD23+B2细胞无影响。相反，在添加抗鼠IL-5中和抗体后，B1细胞的分裂过程被阻止。鉴于FALC NHC分泌IL-5的功能，因此天然辅助细胞可促进B1细胞分裂增殖。将CFSF-lo标记的B1细胞分别转入具有FALC的 Rag2－/－鼠与缺乏FALC的γc－/－Rag2－/－鼠体内，前者经分裂而产生的B1细胞远远多于后者。而将FALC NHC与CFSF-1 标记的B1细胞同时转入γc－/－Rag2－/－鼠体内，B1细胞的分裂过程得以恢复［3］。综上实验，FALC NHC可促进体内B1细胞自我更新。

有害因子，如寄生虫、过敏原、病毒、蛋白酶等，作用于机体内的上皮细胞、内皮细胞或脂肪细胞后，会促使这些细胞产生IL-33与IL-25等警告素，进而激活NHC并使其分泌大量IL-5与IL-13［8］。据报道，嗜酸性粒细胞、肥大细胞、NHC等多种免疫细胞均可分泌IL-5与IL-13，但NHC是免疫系统应答于IL-33进而分泌这两种细胞因子的主要细胞群。据报道，在体外细胞培养试验中，用等量IL-33分别刺激同等数量的NHC、肥大细胞、嗜碱性粒细胞以及极性Th2细胞，NHC所分泌的IL-5与IL-13水平远远高于其余3种细胞［2］。将IL-33注入Rag2－/－鼠体内，鼠体内的IL-5与IL-13水平明显升高并伴有杯状细胞大量增生;而将IL-33注入含有肥大细胞、嗜酸性粒细胞而不含NHC的γc－/－Rag2－/－鼠体内，鼠体内的IL-5与IL-13水平与杯状细胞数量升高不明显。由此可见，在病理状态下，机体产生IL-5与IL-13的主要细胞群为天然辅助细胞。通过分泌IL-5与IL-13，天然辅助细胞参与体内抗寄生虫感染的保护性免疫，并且在一定程度上参与过敏性疾病和呼吸道炎症的病理过程。

图1 天然辅助细胞的生物学功能Fig.1 Functions of natural helper(NH)cells

然而，位于不同器官组织的NHC其生物学活性略有不同。在免疫系统处于稳态时，FALC NHC可持续性产生适量IL-5、IL-6与IL-13［6］，LNH细胞却不能产生IL-6［9］。在IL-33刺激或IL-2与IL-25的共同刺激后，FALC NHC可释放大量IL-5与IL-13;但IL-33对LNH细胞的激活需要辅助刺激信号的参与，如IL-2、IL-7、TSLP。独立的IL-25刺激信号无法激活FALC NHC，亦无法作用于分离培养的LNH细胞，但却可在体内激活LNH细胞。值得注意的是，虽然天然辅助细胞均表达IL-4的相应mRNA，但IL-33或IL-25与IL-2的刺激均无法诱导NHC产生IL-4。迄今为止，只有十四酰佛波乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)与离子霉素的共同作用可诱导IL-4的产生，这是促使NHC分泌IL-4的唯一刺激信号。此外，在PMA与离子霉素的联合刺激下，天然辅助细胞还可产生大量IL-2、IL-5、IL-6、GM-CSF与IFN-r［3］。

4 天然辅助细胞对相关疾病的影响

4.1 在寄生虫感染中的作用

为探究NHC在寄生虫感染中的作用，Moro等人以感染Nippostrongylus brasiliensis的小鼠作为钩虫病的疾病模型。经Nippostrongylus brasiliensis感染后，γc－/－Rag2－/－小鼠因体内缺乏NHC而无法产生足量的IL-5与IL-13，导致杯状细胞增生及黏液分泌受到限制，为寄生虫在肠壁的附着作用提供了适宜的条件，从而缩短了寄生虫在鼠体内的侵袭时间及发育过程。而将从FALC中分离纯化的NHC回输至γc－/－Rag2－/－鼠体内后，鼠体内的IL-5与IL-13水平明显升高，杯状细胞的增生过程得到修复，大量黏液分泌至肠腔，干扰寄生虫在肠壁的依附作用，从而减慢寄生虫的感染进程［3］。然而，据报道，寄生虫的完全驱除需要T细胞的参与，据实验所得，只有将IL-4－/－IL-13－/－CD4+T cell过继转移给Rag2－/－小鼠后，小鼠体内的Nippostrongylus brasiliensis才可被完全清除［2］。因此，NHC在寄生虫的感染过程中发挥辅助性作用，而不能完全驱除成虫。此外Yasuda等人研究了LNH细胞对于肺部寄生虫感染的作用，他们通过使用感染S.venezuelensis的小鼠模型发现:小鼠体内NHC在警告素IL-33的刺激下，大量积聚于肺部，在肺部增殖并分泌高水平的IL-5与IL-13，诱导肺部嗜酸性炎症反应，进而在驱除肺部寄生虫幼虫的过程中发挥辅助性作用［11］。

综上所述，寄生虫侵袭引起机体组织损伤，坏死细胞分泌IL-25与IL-33等警示因子，这些因子作用于NHC等固有免疫细胞，使其产生IL-5与IL-13，进一步促进肺部嗜酸性粒细胞与小肠杯状细胞大量增生。其中NHC是产生IL-5与IL-13的核心固有细胞群。因此，天然辅助细胞可能对于控制寄生虫感染的肺部阶段以及抵抗肠内早期寄生虫的依附发挥关键作用［2，10］。

4.2 参与呼吸道炎症及过敏反应

NHC，尤其是LNH，分泌大量IL-5与IL-13，促进嗜酸性粒细胞与杯状细胞增生，引起呼吸道黏液分泌、平滑肌收缩，并选择性激活巨噬细胞，引起气道高反应性(airway hyper reactivity，AHR)，促进气道重塑［11］，从而参与过敏原(蛋白酶、尘螨、病毒、真菌)介导的呼吸道过敏性疾病及炎症。Halim等人报道了LNH细胞在蛋白酶引起的呼吸道炎症反应过程中发挥重要作用。对Rag2－/－小鼠实施鼻腔注射木瓜蛋白酶的处置后，小鼠肺部嗜酸性粒细胞快速分裂增殖，黏液大量分泌，支气管肺泡上皮细胞灌洗液中IL-5与IL-13的水平明显升高;而对缺乏LNH 细胞的Rag2－/－IL-2rg－/－实施上述处置后，IL-5与IL-13的水平升高不明显。注射CD25mb－中和抗体使LNH细胞失活后，木瓜蛋白酶介导的炎症反应有所缓解。然而，将LNH细胞过继性转入Rag2－/－IL-2rg－/－鼠体内后，嗜酸性粒细胞增殖及黏液分泌的过程得以激活，过敏性症状加重。以上实验说明，LNH细胞在独立于T细胞的过敏性肺部过敏性炎症反应中发挥关键作用［5］。

此外，在真菌及病毒介导的肺部炎症反应及过敏性疾病中，天然辅助细胞也是诱发疾病的关键性因素。据报道，肺部天然辅助细胞参与由H3N1与H1N1流感病毒株感染所引起的呼吸道过敏反应及组织炎症［12-14］。同时，人与鼠体内的NHC均可能持续性表达GAGA-3与EB-1，进一步诱导Th2型细胞因子的分泌，从而加重病原体感染所引起的哮喘［15］。

5 研究局限及前景展望

除了在抗寄生虫感染的保护性免疫及过敏反应中发挥重要作用外，天然辅助细胞可能在脂肪组织中扮演重要角色。近年来，越来越多的实验表明免疫细胞与脂肪细胞的相互作用对调节脂肪组织平衡发挥重要作用。据报道，IL-33介导巨噬细胞M1与M2亚型的相互转换，进而参与脂肪组织的炎症反应过程［16］。那么定位于FALC的NHC在脂肪组织的稳态平衡中具有何作用呢?此外，天然辅助细胞存在于多种组织器官中，并且已知的FALC NHC与LNH细胞在生物学特征及功能方面存在着细微差异［9］，那么，在参与炎症反应时，定位不同的NHC是否具有其独特作用呢?同时，作为一种固有淋巴细胞，NHC只有与其他免疫细胞共同协作方可完成一系列免疫应答。如此而言，NHC与其他固有淋巴细胞、抗原特异性T、B细胞之间的联系及其协同作用机制也成为有待研究的又一课题。另外，对于由不同团队在相同时期发现并给予不同命名的2型固有淋巴细胞群而言，天然辅助细胞与其余3种细胞的关系尚未明了。迄今为止，对NHC的研究仅有两年多历程，诸多问题有待进一步探索与研究。

因NHC可通过产生IL-5与IL-13加重呼吸道过敏性炎症［17］，故调节NHC的发育及功能以达到缓解和治疗相关疾病的目的，成为临床研究热点。目前，多个研究团队以IL-25/IL-33及其受体为靶向目标，利用实验动物模型，通过中和性抗体封闭天然辅助细胞的活化及其生物学功能，进而控制过敏反应及炎症反应［11］。近期研究还发现，RORα是参与NHC发育过程的重要转录因子［4］，因此，能否通过RORα抑制剂来阻碍肺部炎症反应中NHC的产生及其作用值得期待。随着基础医学与临床医学研究的不断深入和进展，人们会对NHC有更加深刻的认识，并逐渐将其应用于临床诊断与治疗的过程中。

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