秦丽云，郭玉梅，吕国平，王 苋，剧慧栋

(石家庄市疾病预防控制中心，河北石家庄 050011)

沙门菌(Salmonella)为革兰阴性杆菌，具有周身鞭毛，有动力，不产生芽胞，是重要的肠道致病菌。经常污染食品、水体和土壤，引起动物和人类的感染。其血清型超过2 000个，我国已发现216个［1］，其引起的食源性疾病位居世界首位［2-3］，据统计，我国由沙门菌引起的食物中毒也已居首位［4］，造成食物中毒的沙门菌是伤寒和副伤寒以外的血清型。引起中毒的食品主要是肉类，其次是蛋类、乳类等。另外，随着分子细菌学研究的开展，有研究表明，沙门菌的侵袭蛋白(invasion protein，inv)决定细菌进入宿主上皮细胞的能力，与沙门菌的致病性密切相关，它是由invA、invB、invC、invD和invE等一组基因编码，其中invA为沙门菌的主要毒力因子［5］。本研究对2011至2012年期间发生在石家庄地区6起由沙门菌引起食物中毒的分离株进行研究，了解分离株的毒力因子携带情况，分析菌株间的血清型和基因型的关系，为食物中毒诊断、溯源及流行病学研究提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2011至2012年期间发生在石家庄市的3个市区、2个县区、1个开发区共6起食物中毒样品分离的16株沙门菌。分子量标准菌株为沙门菌Braenderup血清型全球参考菌株H9812，由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。

1.1.2 试剂 分离培养基购自北京陆桥技术公司，沙门菌显色培养基购自郑州博赛生物技术公司，API 20E生化鉴定卡购自法国梅里埃公司，沙门菌属诊断血清购自宁波天润药业技术公司，沙门菌核酸测定试剂盒(荧光PCR法)购自上海之江科技技术有限公司，SeaKem Gold Agarose购自CAMBREX公司，XbaI核酸内切酶、蛋白酶K均购自TaKaRa公司。

1.1.3 仪器 ABI7500荧光定量 PCR仪(美国ABI)、脉冲场凝胶电泳仪(Bio-Rad CHEF Mapper)、旋转式恒温振荡器、凝胶成像仪(Bio-Rad Gel XR)。

1.2 方法

1.2.1 食物中毒样品检测和菌株血清型测定收集发生在2011至2012年间6起食物中毒样品32份，分别为剩余食品4份、病人吐泻物16份、食品12份。参照GB 4789.4-2010［6］标准进行致病菌的分离培养，用API 20E生化鉴定卡进行生化鉴定，并用沙门菌分型血清进行血清学分型，以确定沙门菌血清型。

1.2.2 沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因的检测采用沙门菌核酸测定试剂盒(荧光PCR法)，按照试剂盒操作说明书进行沙门菌invA基因的检测，挑取分纯的单个菌落加入含有1 000 μL无菌纯水的EP管中，经100℃金属浴中煮沸10 min，离心后取上清液4 μL进行沙门菌invA基因的检测。

1.2.3 沙门菌基因型测定 参照PulseNet China推荐的脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对沙门菌进行基因型研究。挑取沙门菌新鲜培养物制成比浊值为 4.0～4.5个麦氏单位(Mc Farland)，取400 μL 加入20 μL 蛋白酶K(20 mg/mL)混匀，37℃孵育5 min。加入400 μL提前预热好的1%SeaKem Gold琼脂糖溶液(含1%十二烷基硫酸钠SDS溶液)，轻轻吹吸混匀，取200 μL注入模具中，胶块凝固后，放入5 mL含有25 μL蛋白酶K(20 mg/mL)的细胞裂解液CLB中，54℃水浴摇床，转速160 r/min孵育2 h。用15 mL提前预热至50℃灭菌纯水洗胶块2次，每次10 min，再用15 mL提前预热至50℃ TE洗胶块4次，每次15 min。用刀片将琼脂模块切成3 mm左右的胶块，浸入200 μL酶切反应体系中。37℃水浴酶切2 h以上。将酶切后的胶块粘在梳子上制胶，放入Chef Mapper脉冲场凝胶电泳仪上电泳。电泳条件:初始脉冲时间2.16 s;最终脉冲时间63.8 s;电压6.0 V/cm;电场夹角120°;电泳时间18 h;温度14℃。电泳结束后，将胶块放入1 μg/mL的溴化乙啶染色30 min，用纯水脱色5 h以上，在Bio-Rad Gel XR凝胶成像分析系统中读胶成像。

1.2.4 菌株图谱的聚类分析 获得的PFGE图像应用 BioNumerics(Version5.10)数据库软件(Appplied Maths BVBA，Belium)处理，识别图像条带。根据每2个图像之间的相似系数，用非加权配对算数平均法(unweighted pair group average method，UPGMA)进行聚类，条带位置差异容许度(position tolerance)选择0.85%，优化值选择(optimization)1.50%，对分型图谱进行分析，绘出聚类分析图。

2 结果与分析

2.1 食物中毒检测结果及菌株血清分型结果

6起食物中毒均检出沙门菌，共分离出16株沙门菌，血清凝集共分为5种血清型，分别为都柏林沙门菌2株(2/16)、鼠伤寒沙门菌2株(2/16)、肠炎沙门菌8株(8/16)，圣保罗沙门菌3株(3/16)、依麦克沙门菌1株(1/16)。

2.2 沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因的检测结果

经荧光定量PCR仪检测，16株沙门菌invA基因均为阳性结果，荧光PCR实验结果见图1。

2.3 16株沙门菌分离株的PFGE电泳图谱和基因型分析

电泳图像录入BioNumerics软件，经过统一的分子质量标准进行归一化，将条带数目和分布相同的菌株归为同一个PFGE基因型。聚类结果显示，16株沙门菌分为4个基因簇，8株肠炎沙门菌和2株鼠伤寒沙门菌基因型相同，圣保罗沙门菌、都柏林沙门菌和依麦克沙门菌分属于不同的基因型。其中2起由肠炎沙门菌和圣保罗沙门菌引起的食物中毒资料分析显示，1个月内出现3株以上PFGE带型相同的肠炎沙门菌和圣保罗沙门菌，符合同一起暴发的一般规律，应当引起高度重视。每一起食物中毒的分离株PFGE带型分别均相同，聚类分析相似度为100%，考虑为同一来源。见图2。

图1 16株沙门菌荧光PCR试验结果Fig.1 Fluorescence PCR results 16 strains of Salmonella

图2 16株沙门菌食物中毒分离株PFGE聚类图Fig.2 PFGE clustering results of 16 strains Salmonella isolated from food poisoning

3 讨论

沙门菌属是人类肠道传染病的重要病原菌之一，是引起食物中毒的重要病原菌，石家庄地区的6起沙门菌食物中毒共检出了5种血清型，其中肠炎、鼠伤寒、都柏林、圣保罗沙门菌是较常见的引起食物中毒的沙门菌血清型，而依麦克沙门菌是比较少见的，说明食品中沙门菌的污染具有多样性，应引起重视。中毒食品的分布情况，主要集中在动物性食品，占83.33%(5/6)，而该类食品是我国的主要食品，如果对其生产加工和储运及销售各环节加强控制，可能会大大降低沙门菌引起食物中毒的发生。

沙门菌基因组庞大、复杂，有研究表明，沙门菌侵袭蛋白A基因为致病性沙门菌的主要毒力因子［5］，目前用于实时荧光PCR检测的靶基因就是invA基因，本实验检测了16株沙门菌的分离株，PCR检测结果显示，invA的阳性率达到100%，提示在突发公共卫生事件中，可利用invA基因作为沙门菌快速初筛的特异性基因［7］。沙门菌invA基因的检测可为应急处理提供病原学依据，在病原菌快速检测诊断方面具有较好的应用潜力。

本研究结果显示，石家庄地区引起食物中毒的沙门菌分布较广，但仍有优势菌株，以肠炎沙门菌为主要血清型，这与文献［8-9］报道，造成食源性的沙门菌病发生的主要血清型之一是肠炎沙门菌相吻合。肠炎沙门菌是沙门菌常见的血清型之一，具有广泛的寄生谱。在石家庄市的2个区，发生的2起食物中毒均由肠炎沙门菌引起，采用PFGE分子分型方法得到了条带一致的电泳图谱，聚类分析相似度为100%，表明引起这2起食物中毒病原菌与剩余食品的来源菌株，从分子水平具有紧密相关和高度的同源性，菌株来源完全一致。在样品的采集过程中，专门到中毒样品的购买地某超市采集了一份相同的凉拌菜，检出的肠炎沙门菌(编号为SJZ2012CA0004)，与该起中毒事件中来自患者和剩余食品的菌株PFGE图谱完全一致，从分子水平揭示了该超市的凉拌菜与中毒事件的关系，为该起食物中毒流行病学调查提供了充分的依据。该研究案例说明，通过PFGE分子分型不仅可以很好地为食物中毒提供可靠的流行病学依据，而且更重要的是PFGE分子分型调查可以为研究一些散发的事件，或是不同时期的细菌性感染事件之间的关联性提供准确客观的证据。

目前，传统的细菌分型方法一般依据生化反应、血清学分型等表型分型方法，不能用于菌株的相关性分析，而PFGE分子分型方法是通过限制性内切酶对细菌染色体DNA的稀有酶切位点进行酶切，经PFGE分离，比较染色体限制性内切图谱，对整个染色体进行分析，以确定菌株的亲缘关系，能够用于分析菌株之间的相关性，协助追踪污染来源，在有效控制大面积食源性疾病的发生方面发挥重要作用。

致谢:感谢中国疾病预防控制中心传染病所周海健博士对本试验的指导帮助!

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［6］中华人民共和国国家标准.GB 4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门菌检验［S］北京:中国标准出版社，2010.

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