魏福伦　朱里鹏　王庆容

摘要：以患病鲈鱼为材料，从中分离出7株真菌，再筛选出3株真菌，采用形态学特征及分子生物学方法对它们进行鉴定；进一步对其生物学特性进行初步研究，确定其生长的最适温度和pH值。鉴定结果表明，筛选出的3株真菌分别为斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）、变孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）和锈色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。毛霉生长的最适温度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生长；低于10 ℃时枝孢霉菌丝不萌发生长，而高于37 ℃对其生长影响不大。分离到的3种菌株生长的最适pH值是中性偏酸性。

关键词：鲈鱼；可疑性致病真菌；分离鉴定；生物学特性

中图分类号： S917.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0187-03

收稿日期：2013-05-08

基金项目：贵州省科技创新人才团队建设项目[编号：黔科合人才团队（2012）4004]；贵州省遵义市科技局项目[编号：遵市科合社字（2009）26号]。

作者简介：魏福伦（1964—），男，贵州习水人，高级实验师，主要从事经济动物饲养及病害预防的教学和研究工作。E-mail：1050089863@qq.com。

通信作者：王庆容，副教授，主要从事鱼类分子生物学及病害预防的研究工作。E-mail：wqr_1025@163.com。鲈鱼（Lateolabrax japonicus）属于脊索动物门、鱼纲，别称花鲈、鲈板、花寨、鲈子鱼，为常见的经济鱼类之一，也是发展海水养殖的品种[1]。它主要生活在近岸浅海中下层，常栖息于河口咸淡水处，也可生活于淡水中。春夏间幼鱼有成群溯河习性，冬季返归海中，主食鱼、虾类。真菌性疾病是困扰鲈鱼养殖较严重的病害之一[1]，其危害遍及鲈鱼身体的各个部分，但最常见的危害部位是体表，所以对鲈鱼体表寄生的真菌进行分离和鉴定显得尤为重要。

真菌是与人们的生产和生活密切相关的类群，许多种类可以食用和药用，但也有有害的一面，如引起人、畜中毒，尤其是引起皮肤病和内脏病等。为了更好地开发利用或预防它们，对它们作出准确的鉴定尤为必要。大部分菌物的种类多、分布广、形态特征复杂，且少数生理生化指标和形态特征会随着环境的变化而不稳定，导致鉴定费时费力并且不准确。随着生物技术的发展，尤其是分子生物学和生物信息学等相关学科的迅速发展，一系列分子生物学方法逐渐被应用到真菌的分类鉴定中[2]，其中rDNA序列分析是目前真菌分类鉴定中常用的方法，它通过测定真菌rDNA序列的一级结构，将其输入GenBank数据库与同源序列比较来确定其种属关系。将传统分类方法与分子鉴定相结合，可以使真菌分类鉴定更加快速、稳定、可靠。本研究以患病鲈鱼为材料，先扩增分离所得菌株的18S rRNA基因，测定其序列，将测序结果输入GenBank数据库，通过同源性比对确定该菌株所在的属，再根据其形态特征和显微结构鉴定到种。在此基础上，初步研究它们在不同温度和pH值的生长状况，为更好地开发利用或预防它们提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料

乌江偏岩河段网箱养殖场的病害鲈鱼。

1.2菌株的分离和培养

选取几条体表有真菌侵害症状的鲈鱼，分别用无菌水清洗后，用灭菌棉签蘸取损伤部位，用划线法接种到的PDA平板上（每次接种设3个重复）。25 ℃培养，待其长出菌落后，挑取菌落划线转接到另一PDA平板上，多次转板直到培养基上只生长1种菌落。

1.3菌株的分子鉴定

1.3.1真菌DNA的提取将筛选出的真菌接种于PDA平板培养基上常温下培养3 d，从平板上挑取新鲜菌丝放于研磨锅中，加入700 μL的2%CTAB溶液，用灭菌石英砂研磨菌丝体，转移于2 mL的EP管中，在恒温水浴锅上于65 ℃下保温30 min（每10 min振荡1次），离心加等体积氯仿-异戊醇混合液（氯仿 ∶异戊醇体积比24 ∶1）轻轻充分摇匀，4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min。取上清液至一新EP管中，加等体积的异丙醇在常温下静置30 min，12 000 r/min离心10 min。取上清液至一新EP管中，加2倍体积的75%乙醇沉淀DNA，7 500 r/min 离心5 min，倒去上清液后，在室温下晾干，将DNA溶解于50 μL TE缓冲液中，-20 ℃保存备用。

1.3.218S rRNA基因的PCR扩增扩增使用的引物是通用引物NS1与NS6[3]，NS1引物序列为5′-ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACCAC-3′，NS6引物序列为5′-ACCGGAATTCGGCAGGAGCGTAATCAACGC-3′。PCR 扩增体系（50 μL）：10 μmol/L引物各2 μL，Taq 酶 0.5 μL，dNTP 4 μL，10× buffer 5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 34.5 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，59 ℃复性 50 s，72 ℃ 延伸1 min，35 个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工生物工程有限公司测序，测序引物为扩增引物，测序方法为引物行走法。

1.3.3菌株的分子鉴定将菌株的18S rRNA基因序列输入GenBank数据库，用BLAST工具对序列进行同源性比对分析，同时用MEGA 5.1进行分子发育系统树的构建。

1.4菌株的形态学鉴定

将真菌接种到PDA培养基上，25 ℃恒温培养3～12 d，每天观察菌落形态与颜色，再在显微镜下观察其产孢结构、分生孢子梗着生情况及孢子形态、大小、颜色等。

1.5菌株的生物学特性初步研究

1.5.1菌株在不同温度的生长状况将真菌接种在PDA培养基上，在不同温度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培养3～12 d，观察菌株的生长状况。

1.5.2菌株在不同pH值下的生长状况将真菌接种在pH值4、5、6、7、8、9，10、11的PDA培养基上，在25 ℃下培养 3～12 d，观察菌株的生长状况。

2结果与分析

2.1鲈鱼体表可疑性致病真菌的分离结果

从鲈鱼体表一共分离出7株可疑性致病真菌，根据菌落形态及颜色选择3株，分别编号为鲈体表1、鲈体表3、鲈体表7。

2.2菌株18S rRNA基因的PCR扩增及分子鉴定结果

3个菌株18S rRNA基因的PCR扩增结果见图1，3个菌株都扩增出约1 500 bp的片段。将3个菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank数据库中（鲈体表1的登录号为KC977560，鲈体表3的登录号为KC977562，鲈体表7的登录号为KC977559），分子鉴定结果见表1。将3个菌株18S rRNA基因序列与NCBI数据库中的同源序列用MEGA 5.1软件构建系统发育树（图2）。从表1和图2可以看出，鲈体表1属于枝孢属，鲈体表3和鲈体表7属于毛霉属。

2.3菌株的形态观察

2.3.1鲈体表1的形态特征在PDA培养基上，菌落直径为1.30～1.45cm，鼠灰色绒毛状，中央高凸，呈纽扣状，表面

有不规则皱褶，37℃生长良好。在Sabouand培养基上，菌落稍大，灰棕色绒毛状，背面黑色（图3-a）。菌丝灰棕色，丛

生，不分隔（图3-b）。分生孢子椭圆形、枝孢梨形、链生，形成弯曲的芽生孢子短链（图3-c、图3-d）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为丛梗孢目（Miniliales）、暗色孢科（Dematiaceae）、枝孢属（Cladosporium）的斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）[4]。2.3.2鲈体表3的形态特征在PDA培养基上，菌丝生长迅速，无假根，孢子囊梗不成束，单生，繁密成层，直立，孢子囊梗分枝，全部顶生孢子囊（图4-a）；菌丛较高，软弱，先呈白色，后变灰色或褐色；孢子囊梗多分枝，常无菌丝孢子，囊膜易融化，主梗不作轴状分枝。孢子囊多孢子，灰褐色，有囊轴（图4-b）；孢子囊大，球形，孢囊孢子形状不规则，卵形至圆形，壁薄，平滑（图4-c）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为毛霉目（Mucorales）、 毛霉科（Mucoraceae）、 毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）的变孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）[5]。

2.3.3鲈体表7的形态特征在PDA培养基上培养 3～12 d，菌丝萌发时白色，后变为黄色转褐色，背面砖红色。菌丝生长迅速，无假根，孢囊梗不成束，单生，繁密成层，直立，菌丝全部顶生孢子囊，褐色，孢子囊梗长，合轴分枝（图5-a）；孢子囊大，球形，顶生，囊柄易凋萎（图5-b）；孢子囊多孢子，球形，含孢子甚多，灰褐色，有囊轴；孢囊孢子椭圆形，壁薄，平滑（图5-c）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）、毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）的锈色毛霉（Mucor rufescens Fischer）[5]。

2.4可疑性致病真菌的生物学特性

2.4.1不同温度对3种真菌生长速率的影响由表2可以看出，不同温度条件下不同真菌的生长速率不同：3种菌株在5 ℃时都基本不萌发，在一定温度范围内，随着温度升高，真菌生长速率加快，25 ℃左右是真菌生长的最适温度。37 ℃以上时，枝孢属的鲈体表1生长旺盛，生长速率几乎不受影响，而毛霉属的鲈体表3和鲈体表7几乎不能生长。

表2不同温度对3种真菌生长速率的影响

菌株编号1不同温度下的生长速率（cm/d）5 ℃110 ℃115 ℃120 ℃125 ℃130 ℃137 ℃鲈体表11—1—10.2310.2510.3810.3710.40鲈体表31—10.5211.2211.5412.4511.831—鲈体表71—10.5111.1211.4012.0111.731—

2.4.2不同pH值对3种真菌生长速率的影响由表3可以看出，不同pH值条件下不同真菌的生长速率不同：3种菌株在pH值为4～7时均能生长，鲈体表1和鲈体表7在pH值为5时生长最快，鲈体表3在pH值为6时生长最快，在其他pH值条件下生长速率有所下降。总体来说，分离到的3种菌

3讨论

从患病鲈鱼体表中共分离出7株真菌，根据菌落形态及颜色选择3株，分别编号为鲈体表1、鲈体表3、鲈体表7，根据分子鉴定结果和系统发育分析，初步鉴定出鲈体表1属于枝孢属（Cladosporium），鲈体表3和鲈体表7属于毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）。再结合形态学特征和显微结构特点，进一步确定鲈体表1为斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum），鲈体表3为变孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）， 鲈体表7为锈色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。真菌的种类多、分布广、形态特征复杂，且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变

化而不稳定，可能造成鉴定结果有一定偏差，增加了鉴定难度，今后可以尝试用多种培养基进行培养，以求增加鉴定结果的可靠性。

对分离并鉴定的3种菌株进行生物学特性的初步研究，将菌株接种到PDA培养基上，在不同温度下恒温培养，发现毛霉生长的最适温度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生长；低于10 ℃时枝孢霉菌丝不萌发生长，而高于37 ℃对其生长影响不大。将菌株接种到不同pH值的PDA培养基上，于25 ℃恒温培养，发现分离到的3种菌株生长的最适pH值是中性偏酸性。

鲈鱼体表常见的真菌性疾病是水霉病，病原是水霉科的某些种类[6]。本研究从鲈鱼体表的病害部位采集标本，共分离到7种菌株，根据肉眼观察菌落形态进行取舍，在筛选出的3种菌株中没有水霉，可能人为取舍时将水霉丢掉了，也可能是因培养基种类的原因而没有分离到水霉。筛选出的3种菌株中，斑替枝孢霉在人体主要引起脑部的暗色丝孢霉病，肺部和皮肤感染较少见[7]，也没有见到在鱼体上分离到的报道。毛霉属的某些种类能引起人类或其他动物患皮肤病，但变孢毛霉和锈色毛霉是否能引起鲈鱼患皮肤病还有待于进一步确认。

参考文献：

[1]杨秀荣，王庆容.乌江偏岩河段网箱养鱼病害现状与防治对策[J]. 遵义师范学院学报，2008，10（4）：43-44.

[2]林剑伟，阙友雄，陈天生，等. 核糖体DNA的内转录间隔区序列标记在真菌分类鉴定中的应用[J]. 生物技术通讯，2007，18（2）：292-294.

[3]周小玲，沈微，饶志明，等. 一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J]. 微生物学通报，2004，31（4）：89-92.

[4]张中义.中国真菌志：第34卷：枝孢属[M]. 北京：科学出版社，2003.

[5]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979.

[6]金珊，王国良，赵青松，等. 海水网箱养殖鲈鱼的主要疾病与防治[J]. 浙江海洋学院学报：自然科学版，2000，19（1）：51-54.

[7]秦振宇，吴绍熙，谭升顺. 浅析致病真菌分类的动态性[J]. 国外医学：皮肤性病学分册，2000，26（1）：31-34.林小园，刘红全，袁卫生. 海洋微藻的玻璃化冻存技术研究进展[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：190-194.

1.5.1菌株在不同温度的生长状况将真菌接种在PDA培养基上，在不同温度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培养3～12 d，观察菌株的生长状况。

1.5.2菌株在不同pH值下的生长状况将真菌接种在pH值4、5、6、7、8、9，10、11的PDA培养基上，在25 ℃下培养 3～12 d，观察菌株的生长状况。

2结果与分析

2.1鲈鱼体表可疑性致病真菌的分离结果

从鲈鱼体表一共分离出7株可疑性致病真菌，根据菌落形态及颜色选择3株，分别编号为鲈体表1、鲈体表3、鲈体表7。

2.2菌株18S rRNA基因的PCR扩增及分子鉴定结果

3个菌株18S rRNA基因的PCR扩增结果见图1，3个菌株都扩增出约1 500 bp的片段。将3个菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank数据库中（鲈体表1的登录号为KC977560，鲈体表3的登录号为KC977562，鲈体表7的登录号为KC977559），分子鉴定结果见表1。将3个菌株18S rRNA基因序列与NCBI数据库中的同源序列用MEGA 5.1软件构建系统发育树（图2）。从表1和图2可以看出，鲈体表1属于枝孢属，鲈体表3和鲈体表7属于毛霉属。

2.3菌株的形态观察

2.3.1鲈体表1的形态特征在PDA培养基上，菌落直径为1.30～1.45cm，鼠灰色绒毛状，中央高凸，呈纽扣状，表面

有不规则皱褶，37℃生长良好。在Sabouand培养基上，菌落稍大，灰棕色绒毛状，背面黑色（图3-a）。菌丝灰棕色，丛

生，不分隔（图3-b）。分生孢子椭圆形、枝孢梨形、链生，形成弯曲的芽生孢子短链（图3-c、图3-d）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为丛梗孢目（Miniliales）、暗色孢科（Dematiaceae）、枝孢属（Cladosporium）的斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）[4]。2.3.2鲈体表3的形态特征在PDA培养基上，菌丝生长迅速，无假根，孢子囊梗不成束，单生，繁密成层，直立，孢子囊梗分枝，全部顶生孢子囊（图4-a）；菌丛较高，软弱，先呈白色，后变灰色或褐色；孢子囊梗多分枝，常无菌丝孢子，囊膜易融化，主梗不作轴状分枝。孢子囊多孢子，灰褐色，有囊轴（图4-b）；孢子囊大，球形，孢囊孢子形状不规则，卵形至圆形，壁薄，平滑（图4-c）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为毛霉目（Mucorales）、 毛霉科（Mucoraceae）、 毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）的变孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）[5]。

2.3.3鲈体表7的形态特征在PDA培养基上培养 3～12 d，菌丝萌发时白色，后变为黄色转褐色，背面砖红色。菌丝生长迅速，无假根，孢囊梗不成束，单生，繁密成层，直立，菌丝全部顶生孢子囊，褐色，孢子囊梗长，合轴分枝（图5-a）；孢子囊大，球形，顶生，囊柄易凋萎（图5-b）；孢子囊多孢子，球形，含孢子甚多，灰褐色，有囊轴；孢囊孢子椭圆形，壁薄，平滑（图5-c）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）、毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）的锈色毛霉（Mucor rufescens Fischer）[5]。

2.4可疑性致病真菌的生物学特性

2.4.1不同温度对3种真菌生长速率的影响由表2可以看出，不同温度条件下不同真菌的生长速率不同：3种菌株在5 ℃时都基本不萌发，在一定温度范围内，随着温度升高，真菌生长速率加快，25 ℃左右是真菌生长的最适温度。37 ℃以上时，枝孢属的鲈体表1生长旺盛，生长速率几乎不受影响，而毛霉属的鲈体表3和鲈体表7几乎不能生长。

表2不同温度对3种真菌生长速率的影响

菌株编号1不同温度下的生长速率（cm/d）5 ℃110 ℃115 ℃120 ℃125 ℃130 ℃137 ℃鲈体表11—1—10.2310.2510.3810.3710.40鲈体表31—10.5211.2211.5412.4511.831—鲈体表71—10.5111.1211.4012.0111.731—

2.4.2不同pH值对3种真菌生长速率的影响由表3可以看出，不同pH值条件下不同真菌的生长速率不同：3种菌株在pH值为4～7时均能生长，鲈体表1和鲈体表7在pH值为5时生长最快，鲈体表3在pH值为6时生长最快，在其他pH值条件下生长速率有所下降。总体来说，分离到的3种菌

3讨论

从患病鲈鱼体表中共分离出7株真菌，根据菌落形态及颜色选择3株，分别编号为鲈体表1、鲈体表3、鲈体表7，根据分子鉴定结果和系统发育分析，初步鉴定出鲈体表1属于枝孢属（Cladosporium），鲈体表3和鲈体表7属于毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）。再结合形态学特征和显微结构特点，进一步确定鲈体表1为斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum），鲈体表3为变孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）， 鲈体表7为锈色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。真菌的种类多、分布广、形态特征复杂，且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变

化而不稳定，可能造成鉴定结果有一定偏差，增加了鉴定难度，今后可以尝试用多种培养基进行培养，以求增加鉴定结果的可靠性。

对分离并鉴定的3种菌株进行生物学特性的初步研究，将菌株接种到PDA培养基上，在不同温度下恒温培养，发现毛霉生长的最适温度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生长；低于10 ℃时枝孢霉菌丝不萌发生长，而高于37 ℃对其生长影响不大。将菌株接种到不同pH值的PDA培养基上，于25 ℃恒温培养，发现分离到的3种菌株生长的最适pH值是中性偏酸性。

鲈鱼体表常见的真菌性疾病是水霉病，病原是水霉科的某些种类[6]。本研究从鲈鱼体表的病害部位采集标本，共分离到7种菌株，根据肉眼观察菌落形态进行取舍，在筛选出的3种菌株中没有水霉，可能人为取舍时将水霉丢掉了，也可能是因培养基种类的原因而没有分离到水霉。筛选出的3种菌株中，斑替枝孢霉在人体主要引起脑部的暗色丝孢霉病，肺部和皮肤感染较少见[7]，也没有见到在鱼体上分离到的报道。毛霉属的某些种类能引起人类或其他动物患皮肤病，但变孢毛霉和锈色毛霉是否能引起鲈鱼患皮肤病还有待于进一步确认。

参考文献：

[1]杨秀荣，王庆容.乌江偏岩河段网箱养鱼病害现状与防治对策[J]. 遵义师范学院学报，2008，10（4）：43-44.

[2]林剑伟，阙友雄，陈天生，等. 核糖体DNA的内转录间隔区序列标记在真菌分类鉴定中的应用[J]. 生物技术通讯，2007，18（2）：292-294.

[3]周小玲，沈微，饶志明，等. 一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J]. 微生物学通报，2004，31（4）：89-92.

[4]张中义.中国真菌志：第34卷：枝孢属[M]. 北京：科学出版社，2003.

[5]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979.

[6]金珊，王国良，赵青松，等. 海水网箱养殖鲈鱼的主要疾病与防治[J]. 浙江海洋学院学报：自然科学版，2000，19（1）：51-54.

[7]秦振宇，吴绍熙，谭升顺. 浅析致病真菌分类的动态性[J]. 国外医学：皮肤性病学分册，2000，26（1）：31-34.林小园，刘红全，袁卫生. 海洋微藻的玻璃化冻存技术研究进展[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：190-194.

1.5.1菌株在不同温度的生长状况将真菌接种在PDA培养基上，在不同温度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培养3～12 d，观察菌株的生长状况。

1.5.2菌株在不同pH值下的生长状况将真菌接种在pH值4、5、6、7、8、9，10、11的PDA培养基上，在25 ℃下培养 3～12 d，观察菌株的生长状况。

2结果与分析

2.1鲈鱼体表可疑性致病真菌的分离结果

从鲈鱼体表一共分离出7株可疑性致病真菌，根据菌落形态及颜色选择3株，分别编号为鲈体表1、鲈体表3、鲈体表7。

2.2菌株18S rRNA基因的PCR扩增及分子鉴定结果

3个菌株18S rRNA基因的PCR扩增结果见图1，3个菌株都扩增出约1 500 bp的片段。将3个菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank数据库中（鲈体表1的登录号为KC977560，鲈体表3的登录号为KC977562，鲈体表7的登录号为KC977559），分子鉴定结果见表1。将3个菌株18S rRNA基因序列与NCBI数据库中的同源序列用MEGA 5.1软件构建系统发育树（图2）。从表1和图2可以看出，鲈体表1属于枝孢属，鲈体表3和鲈体表7属于毛霉属。

2.3菌株的形态观察

2.3.1鲈体表1的形态特征在PDA培养基上，菌落直径为1.30～1.45cm，鼠灰色绒毛状，中央高凸，呈纽扣状，表面

有不规则皱褶，37℃生长良好。在Sabouand培养基上，菌落稍大，灰棕色绒毛状，背面黑色（图3-a）。菌丝灰棕色，丛

生，不分隔（图3-b）。分生孢子椭圆形、枝孢梨形、链生，形成弯曲的芽生孢子短链（图3-c、图3-d）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为丛梗孢目（Miniliales）、暗色孢科（Dematiaceae）、枝孢属（Cladosporium）的斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）[4]。2.3.2鲈体表3的形态特征在PDA培养基上，菌丝生长迅速，无假根，孢子囊梗不成束，单生，繁密成层，直立，孢子囊梗分枝，全部顶生孢子囊（图4-a）；菌丛较高，软弱，先呈白色，后变灰色或褐色；孢子囊梗多分枝，常无菌丝孢子，囊膜易融化，主梗不作轴状分枝。孢子囊多孢子，灰褐色，有囊轴（图4-b）；孢子囊大，球形，孢囊孢子形状不规则，卵形至圆形，壁薄，平滑（图4-c）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为毛霉目（Mucorales）、 毛霉科（Mucoraceae）、 毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）的变孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）[5]。

2.3.3鲈体表7的形态特征在PDA培养基上培养 3～12 d，菌丝萌发时白色，后变为黄色转褐色，背面砖红色。菌丝生长迅速，无假根，孢囊梗不成束，单生，繁密成层，直立，菌丝全部顶生孢子囊，褐色，孢子囊梗长，合轴分枝（图5-a）；孢子囊大，球形，顶生，囊柄易凋萎（图5-b）；孢子囊多孢子，球形，含孢子甚多，灰褐色，有囊轴；孢囊孢子椭圆形，壁薄，平滑（图5-c）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）、毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）的锈色毛霉（Mucor rufescens Fischer）[5]。

2.4可疑性致病真菌的生物学特性

2.4.1不同温度对3种真菌生长速率的影响由表2可以看出，不同温度条件下不同真菌的生长速率不同：3种菌株在5 ℃时都基本不萌发，在一定温度范围内，随着温度升高，真菌生长速率加快，25 ℃左右是真菌生长的最适温度。37 ℃以上时，枝孢属的鲈体表1生长旺盛，生长速率几乎不受影响，而毛霉属的鲈体表3和鲈体表7几乎不能生长。

表2不同温度对3种真菌生长速率的影响

菌株编号1不同温度下的生长速率（cm/d）5 ℃110 ℃115 ℃120 ℃125 ℃130 ℃137 ℃鲈体表11—1—10.2310.2510.3810.3710.40鲈体表31—10.5211.2211.5412.4511.831—鲈体表71—10.5111.1211.4012.0111.731—

2.4.2不同pH值对3种真菌生长速率的影响由表3可以看出，不同pH值条件下不同真菌的生长速率不同：3种菌株在pH值为4～7时均能生长，鲈体表1和鲈体表7在pH值为5时生长最快，鲈体表3在pH值为6时生长最快，在其他pH值条件下生长速率有所下降。总体来说，分离到的3种菌

3讨论

从患病鲈鱼体表中共分离出7株真菌，根据菌落形态及颜色选择3株，分别编号为鲈体表1、鲈体表3、鲈体表7，根据分子鉴定结果和系统发育分析，初步鉴定出鲈体表1属于枝孢属（Cladosporium），鲈体表3和鲈体表7属于毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）。再结合形态学特征和显微结构特点，进一步确定鲈体表1为斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum），鲈体表3为变孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）， 鲈体表7为锈色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。真菌的种类多、分布广、形态特征复杂，且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变

化而不稳定，可能造成鉴定结果有一定偏差，增加了鉴定难度，今后可以尝试用多种培养基进行培养，以求增加鉴定结果的可靠性。

对分离并鉴定的3种菌株进行生物学特性的初步研究，将菌株接种到PDA培养基上，在不同温度下恒温培养，发现毛霉生长的最适温度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生长；低于10 ℃时枝孢霉菌丝不萌发生长，而高于37 ℃对其生长影响不大。将菌株接种到不同pH值的PDA培养基上，于25 ℃恒温培养，发现分离到的3种菌株生长的最适pH值是中性偏酸性。

鲈鱼体表常见的真菌性疾病是水霉病，病原是水霉科的某些种类[6]。本研究从鲈鱼体表的病害部位采集标本，共分离到7种菌株，根据肉眼观察菌落形态进行取舍，在筛选出的3种菌株中没有水霉，可能人为取舍时将水霉丢掉了，也可能是因培养基种类的原因而没有分离到水霉。筛选出的3种菌株中，斑替枝孢霉在人体主要引起脑部的暗色丝孢霉病，肺部和皮肤感染较少见[7]，也没有见到在鱼体上分离到的报道。毛霉属的某些种类能引起人类或其他动物患皮肤病，但变孢毛霉和锈色毛霉是否能引起鲈鱼患皮肤病还有待于进一步确认。

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[3]周小玲，沈微，饶志明，等. 一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J]. 微生物学通报，2004，31（4）：89-92.

[4]张中义.中国真菌志：第34卷：枝孢属[M]. 北京：科学出版社，2003.

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[7]秦振宇，吴绍熙，谭升顺. 浅析致病真菌分类的动态性[J]. 国外医学：皮肤性病学分册，2000，26（1）：31-34.林小园，刘红全，袁卫生. 海洋微藻的玻璃化冻存技术研究进展[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：190-194.