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新技术交流

PCR-HRM分析筛查成骨不全一家系患儿基因突变

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目的采用PCR-高分辨率熔解曲线（HRM）分析筛查成骨不全（OI）一家系患儿（先证者）COL1A1基因突变位点，探讨其基因型与临床表型的联系。方法对先证者进行家族史及临床资料的调查，采集先证者、家属及50名正常对照者血液标本，应用PCR-HRM分析筛查先证者及正常对照者COL1A1基因突变，基因测序确证突变位点。结果先证者COL1A1基因17外显子筛查结果异常，其熔解温度（Tm）值比正常对照者Tm值低约0.4℃。先证者与正常对照者的标准熔解曲线及差异熔解曲线均有明显差异。测序结果为c.1138G＞A，突变导致380位氨基酸由甘氨酸（Gly）变成丝氨酸（Ser）：p.（Gly 380 Ser），为错义突变。先证者父亲、祖母均具有相同突变位点。先证者母亲及正常对照者基因测序结果无此突变。该突变在中国人群中未见报道。该家系遗传特征为常染色体显性遗传，先证者临床诊断为Ⅳ型OI，临床表型较严重。结论PCR-HRM分析是有效的OI基因筛查新方法。COL1A1基因c.1138G＞A突变在中国人群中为新发现的突变位点。α螺旋结构域Gly被替换可能导致较严重的临床表型。

成骨不全；遗传筛查；聚合酶链反应；点突变；系谱；COL1A1基因；高分辨率熔解曲线分析

成骨不全（osteogenesis imperfecta，OI）又称脆骨病，是一种遗传异质性结缔组织病，与Ⅰ型胶原缺陷相关，患者因骨量减少、骨强度减弱，导致骨脆性增加，表现为易骨折、骨骼畸形及生长缺陷。OI骨骼外表现包括：蓝色巩膜、牙质形成不全和青春期后不同程度的听力损失等[1]。OI发病率约为1/10 000[2]，90％以上OI患者由编码Ⅰ型胶原α1/α2链的基因COL1A1/COL1A2突变引起[3]。OI的临床表现轻重不等，从无明显临床症状到致死型均可发生[1]。基因检测可为OI确诊、产前诊断及遗传咨询提供依据，但COL1A1/COL1A2基因突变缺乏突变热点，基因筛查工作量大、成本高。近年来，高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）分析在医学领域中发展迅速，已在多种疾病的基因突变检测中证实其有效性[4-5]。本研究采用PCR-HRM分析筛查OI家系患儿（先证者）COL1A1基因突变位点，探讨其在OI基因研究中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集1例2011年12月9日在我院住院的OI患儿（先证者）及其家系的临床资料，包括家族史、骨折情况、骨骼畸形、非骨骼异常及X线检查情况等。绘制家系图谱，分析遗传特征。OI家属签署“知情同意书”。先证者男，9岁，汉族。临床诊断为Ⅳ型OI，其父母否认近亲婚配。先证者身高120 cm，体质量23 kg，蓝色巩膜，牙质形成不全，鸡胸。患儿出生后38 d，即发生不明原因的上肢骨折，之后发生约30次四肢骨折，逐渐出现双下肢向前向外弯曲畸形，自3岁后不能行走，双下肢肌肉萎缩。X线片示：胸部畸形、左肱骨远段畸形、双胫腓骨干可见弯曲畸形、双股骨干畸形、关节畸形、骨干纤细、骨皮质菲薄、骨质密度低，胸部、上肢、双下肢骨质疏松，见图1。家系调查显示，先证者父亲、祖母及家系中其他3位亲属均患有OI，见图2。家系患者的临床表型，见表1。

Fig.1 X-rays of the proband图1 先证者X线片

Tab.1 Clinical phenotype of OI family表1 OI家系患者的临床表型

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA制备采集先证者及家属（先证者父亲、母亲、祖母）及50名正常对照者的静脉血，EDTA抗凝。采用美国AxyPrep血基因组试剂盒，提取DNA标本，使用Nano-Drop 2000核酸定量分析仪（德国）检测DNA浓度及纯度，DNA标本放置-80℃保存备用。

1.2.2 引物设计及合成PCR-HRM引物设计参照Gentile 等[6]文献报道，引物设计覆盖了COL1A1基因的编码区和相邻的外显子-内含子交界处。扩增产物大小平均149 bp，对较长或有复杂熔解域的外显子，选择两对或多对引物。引物由上海生工合成。

Fig.2 Pedigree chart图2 家系图

1.2.3PCR-HRM分析筛查COL1A1基因突变采用QIAGEN公司（德国）Type-it HRM PCR Kit试剂盒，饱和染料为EvaGreen。采用基因公司（美国）illumina Eco荧光定量PCR仪，反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性10 s、退火温度（58～64℃）30s、72℃延伸10s，40个循环。每份样本总反应体积为10 μL，PCRMasterMix 5μL，上、下游引物各10μmol/L0.7 μL；模板DNA及无酶水体积之和为3.6 μL，反应体系模板DNA均为30 ng。HRM分析条件为95℃预处理15s，熔解温度为65～95℃，温度上升速率0.1℃/s，每升高1℃采集10次荧光信号数据，Eco V3.0软件对熔解曲线进行分析，每个样本重复2次。

1.2.4 长片段引物的扩增及测序针对PCR-HRM分析异常的基因区域自行设计长片段引物，PCR-HRM分析先证者COL1A1基因17外显子区域结果异常，设计长片段引物，上游：5′-CAGCCCGTTCACTAACACCT-3′；下游：5′-ATTGGCACCTTTAGCACCAG-3′。采用Applied Biosystems公司梯度PCR仪（美国），测序由上海生工完成。

1.2.5 序列分析应用BLAST及GENETOOL等生物信息学软件分析测序结果，与GenBank上的参考序列进行对比分析，确定突变位点及编码氨基酸序列的变化。在人类胶原突变数据库（https://www.le.ac.uk/genetics/collagen/）中确定是否为新发现的突变位点。

2 结果

2.1PCR-HRM分析筛查COL1A1基因突变PCRHRM分析筛查显示，先证者COL1A1基因17外显子区域结果异常，先证者该区域扩增片段的熔解温度（Tm）值为88.6℃，正常对照平均Tm值为（89.0± 0.05）℃，两者Tm值相差约0.4℃。标准熔解曲线提示，先证者COL1A1基因17外显子区域存在杂合突变，见图3。

Fig.3 High resolution melting curve’s图3 HRM熔解曲线

2.2 测序结果COL1A1基因17外显子长片段引物的扩增产物为391 bp，先证者测序结果为：位于COL1A1基因17外显子c.1138G＞A杂合突变，也就是cDNA 1138位碱基G突变成A，先证者父亲及祖母测序结果与先证者相同。先证者母亲及正常对照测序结果与GenBank上参考序列相同，见图4。

Fig.4 Sequencing curves of probands and their families图4 先证者及家属测序图

3 讨论

OI主要由COL1A1/COL1A2基因突变引起，该基因突变散布在整个基因，无突变热点。目前已发现1 100多种COL1A1/COL1A2基因突变。突变形式有单个碱基置换、插入、缺失、重复、移码和剪接位点等。通常每个家系有自己的“私有突变”[7]。Sanger测序被认为是OI基因诊断的金标准[8]，但测序所需工作量大、费用高。2012年，Gentile等[6]首次采用定量PCR-HRM分析筛查OI患者COL1A1/COL1A2基因突变，表明该方法具有快速、成本低及灵敏度高等优点，适于OI基因测序前的突变筛查。HRM分析是新兴的基因筛查和分型的遗传学分析方法[9]，该方法基于有序列变化的扩增产物间微小的Tm值差异及NA片段熔解曲线的差异，进行基因突变筛查，能够区分单个碱基的变化[10]。本研究采用PCR-HRM方法筛查OI患儿COL1A1基因突变，优化了PCRHRM分析条件，筛查出先证者COL1A1基因17外显子Tm值较正常对照低约0.4℃。先证者标准熔解曲线的形状与正常对照明显不同，提示杂合突变。测序结果证实，cDNA的1138位碱基为G/A的杂合突变。先证者父亲及祖母均具有相同的突变位点，先证者母亲及正常对照该测序结果与GenBank上参考序列相同。结合该家系遗传特征，先证者基因突变（c.1138G＞A）来自其父亲及祖母的遗传。

目前，国内对于OI的诊断主要根据临床特征和影像学改变[11]，仍以Sillence分型为主。Sillence等[12]根据患者临床特征和组织病理学特性将OI分为Ⅰ～Ⅳ型，由COL1A1/COL1A2基因突变引起。Ⅰ型病情最轻，多无骨骼畸形，患儿身高正常或接近正常；Ⅱ型最严重，在母体子宫内即发生骨折，常在围产期死亡；Ⅲ型属于非致死型中最严重的亚型，四肢进行性畸形，大多患儿身材十分矮小，牙质形成不全，脊椎压缩和侧弯。Ⅳ型病情属于中度，临床表现多与Ⅰ型和Ⅲ型相同，多数患者可下床行走，巩膜着色，牙质形成不全，听力受损和身材矮小的发生率变异较大[1]。骨折次数、骨骼畸形程度及牙质形成不全通常与疾病的严重程度相关[3]。身材矮小或增长不足是严重OI的又一关键特征[7]。本研究先证者及家系患者身高明显低于正常人，骨折次数7～30次，均有蓝色巩膜、牙质形成不全、下肢畸形，影响行走功能。先证者临床诊断为Ⅳ型OI，家系中OI患者的整体临床表型较为严重。

Ⅰ型胶原蛋白是骨骼、肌腱、韧带和皮肤中的主要细胞外基质蛋白。由2条α1链和1条α2链组成3股螺旋结构，分别由COL1A1和COL1A2基因编码。每条链的螺旋区域含有338个连续重复的Gly（甘氨酸）-X-Y基本结构，Gly在该结构中不可缺少，Gly侧链残基能调节胶原内部3股螺旋的空间结构，对于螺旋正确的折叠至关重要。本研究先证者COL1A1基因17外显子1138位的碱基G突变成A，使380位的Gly替换为Ser，该Gly位于α1链螺旋区域中。已有研究表明，Ⅰ型胶原α1和α2链三股螺旋结构域中最常见的突变形式为Gly被Ser替代，使Ⅰ型胶原结构异常，通常表现为临床表型较为严重的Ⅱ～Ⅳ型[8，13-14]。另外，在分析基因型与临床表型的联系时，还应考虑环境因素及个体差异可能对表型的影响。目前，对于OI基因型和临床表型间的具体关系还不清楚[13]，相关研究及探讨，将为其提供理论基础。

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（2014-01-07收稿2014-02-21修回）

（本文编辑魏杰）

PCR-HRM Analysis for Gene Mutation Screening in a Child with Osteogenesis Imperfecta

BAI Xue1,LI Keqiu2,REN Xiuzhi3,HE Xiaobo2,WANG Yi1,GUAN Shizhen1,JING Yaqing2,LI Guang2
1 Department of Medical Laboratory，Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China；2 Department of Biology,Tianjin Medical University；3 Department of Orthopedics Ward,Tianjin Wu Qing People′s Hospital
LI Guang，E-mail：lig@tijmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate COL1A1 gene mutation by PCR-high resolution melting(PCR-HRM)and analyze the correlation between genotype and clinical phenotype in a child(proband)with osteogenesis imperfecta(OI).MethodsThe family history of OI pedigree along with the clinical data was collected.Blood samples from the proband and his family members,as well as 50 normal controls,were collected.The mutation of COL1A1 gene was screened using PCRHRM and validated by the gene sequence.ResultsThe detection of PCR-HRM showed the abnormal result of COL1A1 17 exon in proband with a lower melting temperature(Tm)value than that of normal controls by 0.4℃.There were significant differences in the standardization melting curve and the different melting curve between the proband and the normal controls.The sequencing result was c.1138G＞A,which meant that cDNA of 1138 base G mutation into A.The mutations transformed the amino acid glycine into a serine at amino acid 380（P.Gly 380 Ser),which resulted in missense mutations.The proband’s father and grandmother had the same mutation of COL1A1 gene.The mutation was not found in the proband’s mother and normal controls.There was no report for such mutation in Chinese population.Pedigree analysis showed the family genetic characteristics of autosomal dominant inheritance.The proband was clinically diagnosed as OI typeⅣwith more severe clinical phenotype.ConclusionPCR-HRM analysis is a new effective method for genetic screening of OI.COL1A1 mutation of c.1138G＞A is a newly discovered mutation in Chinese population.Gly replaced in α helical domain may lead to a more severe clinical phenotype.

osteogenesis imperfecta;genetic screening;polymerase chain reaction;point mutation;pedigree; COL1A1 gene;high-resolution melting

R394.112，R681.31

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.020

国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（2012AA021003）；国家自然科学基金资助项目（21177091）；天津市卫生局科技基金资助项目（2013KZ072）

1天津市天津医院检验科（邮编300211）；2天津医科大学生物学教研室；3天津市武清区人民医院骨科三病区

△通讯作者E-mail：lig@tijmu.edu.cn