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细胞与分子生物学

针对人SND1基因两个AUG的细胞应激分析

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目的针对人SND1基因2个蛋白翻译起始密码子AUG构建真核表达质粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/ 2，并分析2个AUG在SND1应激颗粒形成中的作用。方法以SND1全长转录本为模板，PCR法扩增含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的目的基因SND1-No1/2，双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pCMV-N-Flag，以T4-DNA连接酶将两者连接成pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重组质粒，然后将构建的重组质粒转染入HeLa细胞内，以Western印迹法检测Flag标签（DYKDDDDK）与SND1-No1/2的融合表达，最后以细胞免疫荧光实验检测在氧化应激状态下Flag-SND1-No1/2融合蛋白与内源性SND1应激颗粒的胞内共定位情况。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误，Western印迹结果检测到融合蛋白Flag-SND1-No1/2的表达；细胞免疫荧光结果显示Flag-SND1-No1/2均可与内源性SND1应激颗粒共定位。结论重组pCMV-N-Flag-SND1-No1/2质粒构建成功，SND1基因第1个AUG的缺失并不影响SND1应激颗粒的形成。

重组融合蛋白质类；应激；质粒；基因表达；SND1；AUG；应激颗粒

人类SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白，又称为p100或Tudor-SN（Tudor staphylococcal nuclease），参与基因转录、细胞应激、pre-mRNA剪切等多种生物学过程[1-3]。研究发现，多个物种的SND1基因序列中存在2个蛋白翻译起始密码子AUG[4-5]，而目前对于它的功能探讨尚少见。本课题针对人类SND1基因的两个AUG，分别构建pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重组质粒，在真核细胞内融合表达N端携带Flag标签的SND1-No1蛋白（以第1个AUG为起始点）与SND1-No2蛋白（以第2个AUG为起始点），继而进行细胞免疫荧光实验，从细胞应激角度分析两个AUG在SND1应激颗粒形成中的作用。……