彭树英，雍德祥，王永生

（淮北师范大学 生命科学学院，安徽 淮北 235000）

家禽性别与其生产力密切相关［1］.从分子水平上鉴定禽类性别，为禽类早期胚胎性别鉴定及禽类发育生物学研究提供有意义的途径［2～4］.分子方法主要通过检测W染色体上的性连锁基因及序列实现家禽性别鉴定的.鉴定禽类性别的分子生物学方法很多，相比较而言，PCR技术更灵敏准确，只需从羽毛、血液和胚胎中提取微量DNA样品即可完成性别鉴定［4］.

近几年，在哺乳动物早期胚胎性别鉴定过程中采用一种新的检测方法即环介导等温扩增技术（LAMP）［5-7］.该方法是2000 年由日本科学家Notomi［8］等发明的一种新的核酸扩增技术.LAMP 法产生的扩增产物可通过肉眼定性判断反应结果［9-12］，也可利用染料实施可视化检测.该方法不需要琼脂糖电泳和溴化乙锭染色，提高实验的安全性［13］.因此，此法不仅实现恒温条件下基因快速扩增，且具有操作简单、快速高效、特异性强、灵敏度高、鉴定简便等特点［13］.

目前，在禽类的早期性别鉴定中，至今还未出现关于应用LAMP 法进行禽类早期性别鉴定的报道.因此，本研究以W染色体上假基因序列（EE 0.6序列）为模板，设计LAMP引物，通过对LAMP体系的建立和优化，为建立可以在实际应用中推广的家鸡及早期性别鉴定方法奠定基础，也为家禽类性别鉴定的研究提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

鸡血样本采自安徽省滁州市全椒县十字镇周边的养鸡场.35只雌鸡和45只雄鸡，每个样本在鸡翅分别取1～2 mL静脉血，用ACD抗凝存于4 ℃冰箱备用.

1.2 主要试剂

BstDNA 聚合酶购自NEB 公司；血液基因组DNA 提取试剂盒（DP318-02）及其常规分子试剂均购自天根生化科技（北京）有限公司，其余普通试剂购自上海国药试剂公司.

1.3 引物设计与合成

图1 特异性引物示意图

登陆GenBank 网站查找家鸡W 染色体上假基因EE0.6 序列（基因序列号：D85614），经BLAST 比对，选取此基因高度保守序列作为模板序列，利用在线Primer ExplorerV3.0 软件（http：//primerexplorer.jp/e/）设计 LAMP 内外引物各一对，内引物 FIP和BIP（FIP 由F2和FIc 组成，BIP 由 B2和B1c 组成）和外引物为F3和B3，在EE0.6基因片段上的位置见示意图1.引物由南京金斯瑞公司合成，序列见表1.

表1 引物序列

1.4 全血基因组DNA的提取

用血液基因组DNA提取试剂盒提取家鸡全血基因组DNA（DNA提取步骤按照说明书进行），超微量核酸蛋白测定仪测定基因组DNA浓度和纯度，-20 ℃冻存.

1.5 LAMP反应体系的构建和优化

参照相关文献选取25 μL反应体系：雌雄模板各1 μL，1.5 mmol dNTP，6 mmol MgCL2，10×反应缓冲液2.5 μL，外引物F3/B3各0.2 μmol，内引物FIP/BIP各1.6 μmol，BstDNA聚合酶8U，ddH2O补足至25 μL.95 ℃变性5 min；迅速取出反应管放入冰盒中，加Bst DNA 聚合酶，混匀离心，反应温度设置为60 ℃，61 ℃，62 ℃，63 ℃，64 ℃，65 ℃，66 ℃恒温水浴锅中反应60 min；再加热到80 ℃，5 min后终止反应，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定.确定最佳反应温度后，选择LAMP恒温反应时间分别为45 min，60 min，90 min，120 min确定最佳反应时间.同时对Mg2+浓度、dNTP浓度进行优化.反应管95 ℃加热5 min 后，置于冰上冷却，然后加入8U的Bst DNA 聚合酶，63 ℃恒温反应60 min，最后80 ℃，20 min 终止反应.反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定.

1.6 LAMP家鸡性别鉴定准确性

选取DNA纯度和浓度都较好的雌、雄家鸡全血基因组DNA为模板，用最佳LAMP法反应体系扩增的1 μL模板，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定.

2 结果

2.1 LAMP反应条件和体系的优化

从图2看出，温度在60～66 ℃之间出现梯形条带，经过多次重复试验，确定最佳反应温度为63 ℃.

图2 反应温度的优化

从图3看出，反应时间在30～60 min范围内得到扩增，经多次重复试验，确定最佳反应时间为60 min.

图3 反应时间的优化

从图4看出，Mg2+浓度在4～6 mmol/L 之间出现梯形条带，经多次重复试验，确定最佳Mg2+浓度为6 mmol/L.

图4 Mg2+的优化

2.2 LAMP法鉴定家鸡性别的结果

LAMP法鉴定家鸡性别时，雌性样本都出现梯形条带，而雄性和空白无任何条带（结果如图5），经过多次重复试验，雌雄扩增产物电泳时都出现相似的条带.

3 讨论

3.1 反应体系中各个成分对LAMP法扩增的影响

LAMP的反应体系需要进行不断优化，因为LAMP反应在扩增的时候需要6个引物和酶的共同作用才进行反应，缺一不可，对反应体系中各成分浓度要求比较苛刻.引物序列是影响LAMP 反应的特异性和产量的重要因素之一，所以在设计引物时，必须保证引物退火温度在60～65 ℃之间，因为在这一温度范围内BstDNA 聚合酶才达到最佳活性.另外，引物之间的浓度比也是影响LAMP 扩增的重要因素，B3、F3浓度过高抑制FIP、BIP结合到模板上，导致电泳时没有梯度带或者反应不完全，参照相关文献和优化数据F3、B3与FIP、BIP浓度比最好是1/4～1/8左右.本研究结果表明，浓度比是1/8时结果较为理想.

图5 家鸡性别鉴定

Mg2+浓度过高或过低都会影响LAMP反应，过高会降低反应的特异性，过低会影响BstDNA聚合酶的活性.同时Mg2+与焦磷酸根离子反应生成的焦磷酸镁，是观察反应结果的参数之一.通过比较，本研究确定最适Mg2+浓度为6 mmol/L.

反应温度主要考虑两个因素，一是引物Tm值，过高或过低都会影响引物与模板的结合.二是BstDNA聚合酶的最适温度，反应温度太高或太低都会降低酶的活性甚至破坏酶的结构导致酶失活.但为提高反应的特异性，一般在这两个因素允许范围内选择较高的温度.经过优化，本研究确定退火温度为63 ℃.

dNTPs是反应的底物，加入过多不仅会造成浪费，还会降低反应的特异性；而加入过少会降低反应的敏感性.本研究参照相关文献和优化数据使用dNTP量是2.5 μL，即1.5 mmol/L.

3.2 鉴定结果分析

本实验用LAMP法扩增雌雄家鸡基因组DNA，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳和肉眼直接观察，结果显示雌鸡出现梯型条带，肉眼观察时雌性出现沉淀，雄性和空白无梯形条带.在研究初期，在雌雄样本中均会出现阳性结果，分析可能原因有：一、可能试剂遭到污染；二、鸡可能是兼性鸡，拥有三条染色体分别是ZZW；三、引物设计时选用靶序列并非雌性特异性.为确定造成实验失败的真正原因，首先将雄性样本和一些可能遭到污染的试剂全部换掉，但扩增产物经电泳显示雄性家鸡仍然出现和雌性一样的梯形条带，据此可排除第一个原因.双重PCR鉴定结果发现，雌性两条带，雄性只有一条带.说明样本本身性别无任何问题.经逐一排除，最终确定引物出现了问题，由于引物未完全位于保守序列区，LAMP高灵敏度导致只要有部分碱基结合就可发生扩增，所以导致雌雄家鸡出现了相同的梯形条带.

经过引物的重新设计及反应条件不断的摸索和优化，最终实现利用LAMP 准确有效地鉴定家鸡性别，准确率达到100%.与其他方法相比，LAMP具有很多优越性：操作简单，整个反应在一个水浴锅中即可完成，不需要昂贵、精密的仪器和设备且反应结果可直接通过加核酸染料进行可视化分析；整个反应时间缩短至1 h左右，省去传统PCR的变性，退火，延伸的循环过程；特异性高，由于特异性引物是针对靶序列6个区域设计，其中任何一个区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增；灵敏度高，比传统PCR高出数量级的差异［14-15］，且随着LAMP法的不断完善，它将会有更广泛的临床和科研应用前景.

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