张 彧黄天壬陈 铃何国珍邓 伟张春燕

作者单位：530021 南宁1广西肿瘤防治研究所实验研究部；2广西医科大学附属肿瘤医院输血科；△广西医科大学研究生学院；530001 南宁3广西中医药大学

临床研究

去唾液酸糖蛋白受体2基因在肝细胞性肝癌中的表达及意义

张 彧△黄天壬1陈 铃2何国珍3邓 伟1张春燕1

作者单位：530021 南宁1广西肿瘤防治研究所实验研究部；2广西医科大学附属肿瘤医院输血科；△广西医科大学研究生学院；530001 南宁3广西中医药大学

目的 检测去唾液酸糖蛋白受体2（asialoglycoprotein receptor 2，ASGR2）基因在肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中的表达水平，探讨ASGR2在HCC发生、发展中的作用和意义。方法 以RT-PCR法检测55例HCC患者、55例非肝癌的其他肿瘤患者和33例非肿瘤的其他疾病对照患者外周血液中ASGR2基因的表达水平，并分析其意义。结果 肝癌组和非肝癌的其他肿瘤组患者血液中ASGR2基因阳性表达率分别为85.5%、65.5%，两组差异有统计学意义（P＜0.05），肝癌组和非肿瘤的其他疾病对照组ASGR2基因阳性表达率分别为85.5%、78.8%，两组差异无统计学意义（P＞0.05），ASGR2基因在3组患者外周血液中的表达水平有明显差异（P＜0.05）。ASGR2基因的表达与HCC患者的性别、年龄、AFP、肝硬化、肿瘤家族史等临床病理特征均无统计学意义（P＞0.05）。结论 ASGR2基因的表达水平可能与HCC发生、发展有关，检测ASGR2的水平有望作为HCC早期发病的预测指标。

肝肿瘤；肝细胞性肝癌；去唾液酸糖蛋白受体2；基因；表达

去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）是一种跨膜蛋白，其特异性地表达在肝脏窦状隙细胞表面。ASGPR主要由两个亚基组成，体内糖蛋白的去唾液酸糖蛋白受体1（ASGR1）和去唾液酸糖蛋白受体2（ASGR2）两个亚基联合具有内吞作用［1］。ASGPR能够结合血液循环中的N-乙酰氨基半乳糖基和末端带有半乳糖基的糖蛋白在肝细胞中进行代谢［2］。近年来，许多研究提示ASGPR是肝癌基因治疗研究最多的靶向受体［3］。本研究采用半定量逆转录聚合酶链式反应技术（RT-PCR），从mRNA水平检测肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者血液中ASGR2基因的表达情况，探讨其在HCC发生、发展中的作用和意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

肝癌组：55例外周血液标本来自广西医科大学附属肿瘤医院2012年11月至2013年1月手术切除的HCC患者，其中男性45例，女性10例，年龄32～74岁，平均年龄50.9岁。其中伴有肝炎者占56.36%，甲胎蛋白阳性者占24.07%。全组病理诊断均为HCC。非肝癌的其他肿瘤组：55例全血标本来自广西医科大学附属肿瘤医院非肝癌的其他肿瘤患者，其中男性40例，女性15例，年龄24～72岁，平均年龄51.2岁。病理诊断均无肝脏转移。非肿瘤的其他疾病对照组：33例全血标本来自广西医科大学第一附属医院非肿瘤的其他疾病患者，其中男性19例，女性14例，年龄13～68岁，平均年龄38.0岁。所有标本的疾病均经病理学及临床检查证实。标本采集均征得患者知情同意。

1.2 主要试剂

全血RNA提取试剂盒（Catrimox-14 RNA Isolation Kit）为宝生物工程（大连）有限公司，逆转录试剂盒为Fermentas公司。

1.3 方法

采集研究对象空腹静脉血液2 ml，以EDTA-Na抗凝，取100 μl全血按Catrimox-14 RNA Isolation Kit试剂盒说明书的方法抽提总RNA。取2 μl RNA在酶标仪上测定RNA浓度。基因引物如下：内参为GAPDH，上游引物为5′-AAG AAG GTG GTG AAG CAG GC-3′；下游引物为5′-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CC-3′。ASGR2基因的上游引物为5′-AAC ACA CGA ACC CCT TCA ATA C-3′；下游引物为5′-CCT CCT TTC TCT CTT TGC TCA G-3′。RT-PCR反应条件：预变性96℃10 min，变性98℃10 s，退火55～60℃30 s，延伸72℃1 min/kbp，30个循环，最后延伸72℃7 min。PCR反应体积共50 μl，Premix Ex Taq25 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，模板2 μl，灭菌蒸馏水21 μl。RT-PCR产物半定量分析：取10 μl PCR产物和5 μl Marker经2%琼脂糖凝胶电泳，电压120V 30 min，核酸染料10 μl/100 ml。用RT-PCR法检测ASGR2基因在肝癌组、非肝癌的其他肿瘤组及非肿瘤的其他疾病对照组中的表达水平，在紫外灯下观察结果并拍照。

1.4 统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。ASGR2基因在肝癌组、非肝癌的其他肿瘤组和非肿瘤的其他疾病对照组患者外周血液中的表达率和表达量采用χ2检验和t检验进行比较分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASGR2基因表达的阳性率

ASGR2基因在肝癌组患者中的阳性表达率为85.5%，在非肝癌的其他肿瘤组患者中的阳性表达率为65.5%，在非肿瘤的其他疾病对照组患者中的阳性表达率为78.8%。肝癌组与非肝癌的其他肿瘤组比较，ASGR2基因阳性表达率的差异有统计学意义（χ2=5.939，P＜0.05）；肝癌组与非肿瘤的其他疾病对照组比较，ASGR2基因阳性表达率的差异无统计学意义（χ2=0.648，P＞0.05）。见表1。

表1 ASGR2基因在各组患者中阳性表达的情况［n（%）］

2.2 ASGR2基因RT-PCR产物的电泳结果

ASGR2基因在肝癌组、非肝癌的其他肿瘤组和非肿瘤的其他疾病对照组的表达见图1。ASGR2基因扩增产物长度为391 bp。

图1 ASGR2基因PCR扩增产物的电泳结果注：M.marker；A、B.肝癌组；C、D.非肝癌的其他肿瘤组；E.非肿瘤的其他疾病对照组；G1～G5.GAPDH。

2.3 ASGR2基因的表达与HCC临床病理特征的关系

ASGR2基因的表达水平与HCC患者的性别、民族、年龄、AFP、肝炎、吸烟、饮酒、肝硬化和肿瘤家族史等临床病理特征的关系均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.4 ASGR2基因表达水平的比较

RT-PCR分析显示肝癌组患者ASGR2 mRNA的相对表达量为（1.026±0.058），明显高于非肝癌的其他肿瘤组的（0.395±0.093），差异有统计学意义（t=14.089，P=0.000），亦明显高于非肿瘤的其他疾病对照组的（0.764±0.061），差异有统计学意义（t=37.638，P=0.000）。3组患者ASGR2 mRNA的表达量比较，差异有统计学意义（F=114.670，P＜0.05）。

表2 ASGR2基因的表达水平与HCC患者临床病理特征的关系（n）

3 讨论

肝脏窦状隙细胞表面富含ASGPR，体内糖蛋白被去唾液酸作用后通过ASGPR途径在肝细胞内被吸收，提示其在肝癌的基因靶向治疗中具有潜在的应用前景［4］。目前，国内外对ASGPR的研究比较活跃，尤其在ASGPR基因的肝癌基因治疗及抗HBV的研究较多。ASGPR在肝癌细胞表面大量表达，肿瘤靶向药物可利用ASGPR的介导递送到HCC［5，6］。有研究报道反义寡糖核苷酸（ASODN）能下调ASGPR的表达水平，在不影响其他正常细胞的同时明显抑制HBV的复制［7，8］。本研究在前期研究的基础上［9］，应用RTPCR技术，从mRNA水平检测ASGR2基因在肝癌组、非肝癌的其他肿瘤组和非肿瘤的其他疾病对照组患者外周血液中的表达情况。结果显示，肝癌组和非肿瘤的其他疾病对照组间ASGR2 mRNA的阳性表达无差异（P＞0.05），而与非肝癌的其他肿瘤组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步将ASGR2基因在3个组中表达的mRNA进行半定量分析，结果表明ASGR2基因在肝癌组患者外周血液中的mRNA表达水平明显高于非肝癌的其他肿瘤组和非肿瘤的其他疾病对照组（P均＜0.05），提示ASGR2基因表达水平的升高可能与HCC发生、发展密切相关。进一步分析显示ASGR2基因的表达水平与HCC患者的性别、年龄、AFP、肝炎、吸烟、饮酒、肝硬化和肿瘤家族史等临床病理特征均无相关性（P均＞0.05）。

综上，本研究表明肝癌组患者外周血液中ASGR2 mRNA的表达水平较非肝癌的其他肿瘤组和非肿瘤的其他疾病对照组升高，提示外周血液中ASGR2基因的表达可能对HCC的早期诊断有意义，检测ASGR2基因的表达有望作为HCC发病的预测指标。本研究未采集各种肝病标本与肝癌标本进行对比，其原因已有研究报道ASGPR与多种肝脏相关疾病如病毒性肝炎、肝硬化和肝癌密切相关［10，11］。近年来，ASGPR介导的肝脏相关疾病靶向药物的释放、转运、代谢、排泄机制等尚未清晰［12］，有待进一步研究，以在肝脏疾病防治方面发挥更大作用。

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［2013-10-13收稿］［2013-11-26修回］［编辑 阮萃才］

Asialoglycoprotein receptor 2 gene expression and significance in hepatocellular carcinoma

ZHANG Yu△，HUANG Tian-ren1，CHEN Ling2，HE Guo-zhen3，DENG Wei1，ZHANG Chun-yan1（1Department of Research，Guangxi Cancer Institute；2Department of blood transfusion，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；△Graduate School of Guangxi Medical University；3Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530021，P.R.China）

HUANG Tian-ren.E-mail：tianrenhuang@yahoo.com.cn

Liver neoplasms；Hepatocellular carcinoma；Asialoglycoprotein receptor 2；Gene；Expression

R735.7

A

1674-5671（2014）01-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.04

国家自然科学基金资助项目（30960333）；广西自然科学基金资助项目（桂科自0991017Z）；广西高校科研项目［桂教科研（2003）22号］

黄天壬。E-mail：tianrenhuang@yahoo.com.cn

【Abstract】Objective To explore the expression and possible significance of asialoglycoprotein receptor 2（ASGR2）gene in hepatocellular carcinoma（HCC）.Methods Expression of the ASGR2 gene in peripheral blood was detected by RT-PCR in 55 patients with hepatocellular carcinoma，55 patients with non-HCC tumors，and 33 non-tumor control patients.Results Expression of the ASGR2 gene was detected in significantly more HCC patients（85.5%）than in non-HCC patients（65.5%，P<0.05）；in fact，the rate of positive expression was similar among HCC patients as in non-cancer controls（78.8%，P＞0.05）.Gene expression differed significantly across all three patient groups（P<0.05）.ASGR2 gene expression was not significantly associated with clinicopathological features of HCC，age，AFP，cirrhosis，or cancer family history（P＞0.05）.Conclusion ASGR2 gene expression may be associated with HCC development，and detecting expression may serve as an early predictor of pathogenesis.