孔 娜匡志鹏 杨 帆 李韵秋吴继宁

作者单位：530021 南宁 广西肿瘤防治研究所实验研究部；△广西医科大学研究生学院

基础研究

Axin-1在C57BL/6J小鼠肝癌模型发生过程中的表达及意义

孔 娜△匡志鹏 杨 帆 李韵秋△吴继宁

作者单位：530021 南宁 广西肿瘤防治研究所实验研究部；△广西医科大学研究生学院

目的 检测Wnt/β-catenin信号通路中Axin-1在化学诱导C57BL/6J小鼠肝癌模型发生过程中的表达水平，揭示Wnt/β-catenin通路与肝癌发生的关系。方法 95只C57BL/6J小鼠随机分为实验组50只和对照组45只。实验组小鼠以联合二乙基亚硝胺（DEN）/四氯化碳（CCl4）/乙醇诱导建立小鼠肝癌模型，对照组未予任何特殊处理。每2周定期处死两组小鼠各5只，并取肝组织进行病理学观察，以实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术、Western blot法、免疫组化法检测并动态观察Axin-1 mRNA和蛋白水平的表达情况。结果 小鼠经化学诱导20周后成功诱发小鼠肝癌并建立小鼠肝癌模型。RT-PCR和Western blot法检测显示，Axin-1 mRNA和蛋白水平的表达在诱导的第4周至第14周，实验组和同期对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；在诱导的第16周至第20周实验组和同期对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且随着诱癌时间的延长，实验组Axin-1的表达逐渐降低，在诱导的第16周、第18周和第20周Axin-1 mRNA的相对表达量分别为0.421±0.083、0.278±0.042、0.120±0.028（P＜0.05）。免疫组化法检测显示Axin-1在对照组各诱导期均为阳性表达，实验组从第16周开始Axin-1的表达减弱，至第 20周时Axin-1几乎不表达。结论 Wnt/β-catenin信号通路可能与肝癌的发生、发展有关，其中Axin-1可能起着负性调节的作用。

肝肿瘤；Wnt/β-catenin信号通路；Axin-1；化学诱癌

目前，肝癌在世界范围内男性和女性癌症死因中分别居于第二位和第六位［1］。肝癌的发生、发展是一个多因素、多基因和多阶段共同作用的复杂过程，其具体发病的机制仍不清楚。目前已有研究发现，多条信号通路如Wnt通路、Hedgehog通路、Notch通路等对肝癌的发生、发展和转移起着至关重要的作用。其中Wnt/β-catenin信号通路已成为研究肝癌发病机制的热点。有研究发现肝癌中存在Wnt通路的异常激活［2］。本文通过诱导建立C57BL/6J小鼠肝癌模型，观察肝癌形成过程中Wnt/β-catenin信号通路中Axin-1的表达变化，为进一步研究Wnt/β-catenin信号通路对肝癌发生、发展过程的调控作用打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

C57BL/6J雄性小鼠6~8周龄，体重20~30 g，购于中国科学院上海实验动物中心，符合国标GB14922-94 SPF级质量标准。二乙基亚硝胺（DEN）购于美国Sigma公司，四氯化碳（CCl4）购于天津化学试剂研究所，乙醇、橄榄油购于北京化学试剂公司，RNA提取试剂Trizol购于美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国Thermo公司，SYBR®Premix Ex Taq TM购于日本TaKaRa公司。蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂PMSF、BCA试剂盒为碧云天生物技术研究所产品，GAPDH、Axin-1一抗购于美国Cell Signaling公司，二抗购于美国Proteintech Group公司。免疫组化试剂盒SP-9001、浓缩型DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 化学诱导小鼠肝癌模型的建立

化学诱导小鼠肝癌模型的建立参照文献［3，4］。即95只C57BL/6J雄性小鼠购入后先适应环境7d，然后随机分为实验组50只和对照组45只。实验组小鼠首先以DEN 100 mg/kg腹腔注射。3d后以CCl4和橄榄油（配比体积为20∶80）按每次5 ml/kg灌胃，2次/周，第3周以DEN 50 mg/kg腹腔注射1次，同时给予含有9%乙醇的饮用水饮用，第4周开始加大CCl4的剂量至8 ml/kg，共给药20周。对照组小鼠不予任何特殊处理。两组动物均喂以颗粒饲料，并自由饮用灭菌的普通水。实验期间观察两组小鼠的生长、体重、精神和食欲等情况。在诱癌开始后的第4周、第6周、第8周、第10周、第12周、第14周、第16周、第18周和第20周，从实验组和对照组中各随机抽取5只小鼠，手术摘取肝脏组织做后续实验。

1.3 病理组织学观察

取实验组和对照组新鲜的小鼠肝组织，经3%中性多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成5 μm的切片，HE染色后在光学显微镜下观察病理组织学的变化。

1.4 RT-PCR检测Axin-1mRNA的表达

利用Trizol提取总RNA，用紫外分光光度计测定提取的RNA的浓度。取3 μg总RNA，根据逆转录试剂盒的说明书逆转录成cDNA。PCR引物由上海生工设计合成，引物序列如下：Axin-1上游引物为5′-TACCTCACATTCCTCGCACTTA-3′，下游引物为5′-TCCAACTTTTCTTCAGCCTCTC-3′，产物大小为127 bp；内参β-actin上游引物为5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′，下游引物为5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′，产物大小为148 bp。将样品cDNA稀释16倍后取样2 μl，按照TaKaRa Real-Time PCR试剂盒的说明书在冰上配制PCR反应液，反应体系为20 μl。使用BIO-RAD Real-Time PCR仪进行扩增，反应条件为95℃变性30 s，95℃5 s，60℃30 s，共40个循环。反应结束后建立溶解曲线并分析。将仪器自动获取的Ct值用2-ΔΔCt法计算Axin-1基因的相对表达量。

1.5 蛋白提取及Western blot法分析Axin-1蛋白的表达水平

在20 mg肝组织中加入150 μl含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，低温匀浆提取总蛋白。按BCA试剂盒的说明书测定蛋白浓度，-80℃贮存备用。取50 μg蛋白标本加入上样缓冲液，100℃变性5 min，在10% SDS-PAGE凝胶中电泳1.5 h，将蛋白移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，4℃孵育一抗过夜（GAPDH和Axin-1一抗稀释比例均为1∶1 000），然后再与1∶6 000的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后显影和定影。以Quantity One软件测定各蛋白条带的灰度值，计算Axin-1/GAPDH的灰度比值。

1.6 免疫组化法检测Axin-1蛋白的表达

石蜡切片常规脱蜡，用30 ml/L H2O2灭活内源性酶10 min，枸橼酸盐缓冲液抗原修复，然后按免疫组化SP法试剂盒的说明书进行反应，DAB染色和苏木精复染。Axin-1一抗工作浓度为1∶300，以PBS代替一抗作为阴性对照，每次实验均设阴性对照。Axin-1蛋白定位于细胞质，以出现棕黄色或棕色颗粒的细胞为阳性细胞。

1.7 统计学处理

使用SPSS 16.0软件进行统计学分析。采用完全随机设计资料的方差分析和t检验对资料进行比较和分析，以α=0.05的检验水准判断差异有无统计学意义。

2 结果

2.1 化学诱导小鼠肝癌病理组织学的改变

实验组小鼠在诱癌的第8周、第18周和第20周分别死亡2只、2只和1只，死亡率为10%（5/50）；对照组45只小鼠无死亡。化学诱导20周后成功诱发小鼠肝癌。实验组小鼠在诱导的第8周可见部分肝细胞损伤，细胞变性水肿，有炎性细胞浸润；第16周肝细胞排列紊乱，细胞开始出现异型性增生，核圆形深染，可见核分裂相；第20周出现肝癌，癌细胞呈多边形，核大深染，大小不等，核分裂相明显，核质比增大，细胞异型性明显。对照组小鼠的肝组织结构正常，肝细胞呈索状排列，大小一致。见图1。

图1 化学诱导期两组小鼠肝组织病理组织学的改变

2.2 RT-PCR法检测Axin-1 mRNA的表达变化

如图2所示，实验组小鼠Axin-1 mRNA的表达在诱导的第4周至第14周和同期对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；在诱导的第16周至第20周实验组小鼠Axin-1 mRNA的表达和同期对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且随着诱癌时间的延长，实验组小鼠Axin-1 mRNA的相对表达量逐渐降低，在诱导的第16周、第18周和第20周Axin-1 mRNA的相对表达量分别为 0.421±0.083、0.278±0.042、0.120±0.028（P＜0.05）。

图2 化学诱导期两组小鼠Axin-1 mRNA的表达变化

2.3 Western blot法检测Axin-1蛋白的表达水平

如图3和表1所示，实验组小鼠Axin-1蛋白的表达水平在诱导的第16周之前和同期对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而在第16周之后实验组和同期对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；随着诱癌时间的延长，实验组小鼠的Axin-1蛋白的相对表达量在第16周、第18周和第20周逐渐降低并且差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图3 Western blot法检测两组小鼠Axin-1蛋白的表达

表1 化学诱导期小鼠肝组织Axin-1蛋白的表达水平（s）

表1 化学诱导期小鼠肝组织Axin-1蛋白的表达水平（s）

注：*与同期对照组比较，P＜0.05；▲与前一实验周期比较，P＜0.05。

诱导时间Axin-1蛋白的表达实验组 对照组第4周 0.622±0.026 0.615±0.019第6周 0.640±0.050 0.603±0.024第8周 0.602±0.051 0.584±0.055第10周 0.613±0.029 0.578±0.039第12周 0.586±0.049 0.587±0.034第14周 0.613±0.022 0.595±0.022第16周 0.392±0.035*▲0.595±0.021第18周第20周0.323±0.013*▲0.188±0.016*▲0.595±0.014 0.591±0.031

2.4 免疫组化法检测Axin-1蛋白的表达

免疫组化法检测显示，Axin-1蛋白在对照组小鼠诱导各期中均为阳性表达，第16周至第20周实验组均较同期对照组Axin-1蛋白的表达减弱；随着诱癌时间延长，实验组小鼠Axin-1蛋白的阳性表达逐渐减弱，至20周时几乎不表达。见图4。

3 讨论

Wnt/β-catenin信号通路常被称为经典Wnt信号通路，其将信号分子通过级联方式，由细胞膜经过细胞质转导至细胞核［5］。当Wnt信号缺失时，Axin-1与APC、CK1α和GSK-3β形成摧毁复合体，它能有效地募集到β-catenin，并且保持丝氨酸苏氨酸残基磷酸化，从而引起泛素-蛋白酶体介导的降解过程［6］。而在Wnt信号通路活化的状态下，β-catenin的活化被抑制，Axin的表达减少，大量β-catenin聚集转移至核内引起靶基因转录。经典Wnt信号通路不仅在胚胎发育、细胞再生中起着重要作用，而且其异常的持续活动与多种恶性肿瘤的发生、发展有关。

图4 免疫组化法检测两组小鼠化学诱导期Axin-1蛋白的表达

Axin-1是Wnt信号通路中重要的负性调节因子。Axin-1在结肠癌、神经上皮瘤和髓母细胞瘤以及肝细胞癌等恶性肿瘤的错义突变中均可降低其表达水平［7，8］。Taniguchi等［9］在73例肝细胞癌和27例肝母细胞瘤中发现Axin-1的基因突变分别为9.6%和7.4%，除了大约20%肝细胞癌和80%肝母细胞瘤的发生是由于β-catenin突变外，其他10%的肝细胞癌和肝母细胞瘤可能是由于Axin-1和Axin-2突变的结果。另外，β-catenin和Axin-1基因突变发生在肿瘤形成的晚期阶段，而不参与早期肝细胞癌的发生［10］。另有研究发现，Axin-1功能的缺失与β-catenin功能的增加是不同步的，暗示着Axin-1可能受肝癌中其他通路的调控［11］。Yang等［12］分析基因组序列发现Axin基因启动子富含CpGs，有数据表明Axin基因的甲基化可能与肺癌的发生、发展有一定的联系。腺病毒转染的Axin-1可抑制肝癌细胞的扩散，诱导肿瘤细胞的凋亡［13］。Huang等［14］的实验结果表明，Axin的1~87号氨基酸片段可增加内源性Axin蛋白水平而不影响mRNA的表达，它并不是Axin缺失结构域后的突变产物。

本实验以DEN/CCl4/乙醇诱导C57BL/6J小鼠20周，成功地诱发小鼠肝癌并建立小鼠肝癌动物模型。此模型具有与人肝癌相似的病理过程［3］，对研究人肝癌具有十分重要的意义。本实验有以下发现：①实验组小鼠在化学诱癌第16周之前，肝组织细胞变性水肿、坏死，处于一个药物性肝炎的阶段，此时以RT-PCR技术、Western blot法和免疫组化法检查，结果显示，实验组和同期对照组小鼠Axin-1蛋白的表达无明显差异，提示在细胞变性水肿阶段Axin-1蛋白的表达无明显变化；②实验组小鼠在诱导第16周之后细胞开始出现异型性增生，出现核分裂相，直至第20周细胞异型性明显，此时以RT-PCR技术和Western blot法检测显示实验组小鼠Axin-1蛋白的表达水平和同期对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且随着诱癌时间的延长，Axin-1蛋白的表达逐渐降低；免疫组化法检测示实验组小鼠诱导第16周和第20周Axin-1蛋白的表达减弱，这种变化与小鼠肝组织的病理变化相关，此时肝脏经历了肝硬化、非典型增生和肝癌的阶段，Axin-1可能发生错义突变，抑制GSK-3β的活性和β-catenin的磷酸化，使β-catenin进入细胞核并对下游靶基因进行核转录，激活Wnt信号通路导致肝癌的发生、发展。这与Park等［10］的Axin-1基因突变发生在肿瘤形成的晚期阶段而不参与肝细胞癌早期的发生互相一致。

综上，本实验采用DEN/CCl4/乙醇联合诱导C57BL/6J小鼠肝癌模型，在小鼠成癌过程中动态监测Axin-1的表达水平，结果提示Wnt信号通路参与了小鼠肝癌的发生、发展，Axin-1作为负性调节因子可能激活Wnt信号通路，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。进一步研究Axin-1在肿瘤形成过程中的表达逐步减少的机制，有望使其成为肿瘤治疗的靶点，有关方面值得深入研究。

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［2013-12-26收稿］［2014-01-25修回］［编辑 阮萃才］

Expression and significance of Axin-1 during chemical induction of liver cancer in C57BL/6J mice

KONG Na△，KUANG Zhi-peng，YANG Fan，LI Yun-qiu△，WU Ji-ning（Department of Research，Guangxi Cancer Institute；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

KUANG Zhi-peng.E-mail：kgzhou@163.com

Objective To analyze the expression of Axin-1 during chemical induction of liver cancer in C57BL/6J mice.Methods C57BL/6J mice were divided randomly into an experimental group（n=50）and a control group（n=45）.Mice in the experimental group were treated with diethylnitrosamine（DEN），carbon tetrachloride（CCl4）and ethanol for 20 weeks to induce hepatocellular carcinoma（HCC）.Every 2 weeks，5 mice in each group were sacrificed and liver samples were taken.Dynamic expression of Axin-1 was analyzed using real-time PCR，Western blotting and immunohistochemistry，while pathological changes were analyzed using hematoxylin staining.Results The 20-week DEN/CCl4/ethanol treatment successfully induced liver cancer in C57BL/6J mice.Based on real-time PCR and Western blotting，expression of Axin-1 mRNA and protein was significantly lower in the experimental group than in the control group between weeks 16 and 20.This expression decreased gradually over time in the experimental group：levels of mRNA were 0.421±0.083 at week 16，0.278±0.042 at week 18 and 0.120±0.028 at week 20（P＜0.05）.Immunohistochemistry showed detectable levels of Axin-1 staining in the control group at all time points tested；in the experimental group，however，the level of staining began to decrease at week 16 and was nearly undetectable at week 20.Conclusion The Wnt/β-catenin signalingpathway may be associated with HCC development，with Axin-1 acting to inhibit HCC progression.

Liver neoplasm；Wnt/β-catenin；Signaling pathway；Axin-1；Chemical carcinogenesis

R735.7

A

1674-5671（2014）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.02

国家自然科学基金资助项目（30760278）

匡志鹏。E-mail：kgzhou@163.com