薄双玲，马太芳，白慧健，宋小峰，田 鹤

(1.山西医科大学汾阳学院组织胚胎学教研室，山西汾阳 032200； 2.辽宁医学院组织胚胎学教研室，辽宁锦州 121001)

去整合素金属蛋白酶9(a disintegrin and metalloproteinase 9, ADAM9)是ADAM家族的重要成员之一，功能活跃，广泛表达于各种组织，具有多种生物活性。ADAM9主要通过胞外域脱落、基质降解和细胞接触来发挥作用，有多种配体，涉及不同信号通路及信号分子，从而调节胞内信号传导过程[1]。ADAM9参与了多种生理和病理过程[1-3]。YAN等人已报道了ADAM9在发育小鸡的脊髓、耳蜗、晶状体等处的表达情况[4-5]，然而关于ADAM9与小鼠肾发育方面的研究尚少见报道。本研究采用免疫组织化学技术结合体视学方法及免疫印迹法检测ADAM9 在小鼠肾发育中的时空表达及其含量变化,从而探讨ADAM9 与肾分化发育的关系。

1 材料与方法

1.1组织取材及标本制备成年健康昆明系小白鼠雌、雄(1∶1)同窝饲养，每日早晚8∶00时检查雌鼠妊娠情况，以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄(embryonic days, E)0 d。孕鼠分笼饲养2周后，每日早晚8∶00时观察其生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后(postnatal, P)0 d。孕鼠共分为10组，每组4只，从每只孕鼠取2只胎鼠或仔鼠，分别取胚龄11、14、16、18 d胎鼠和生后1、3、7、14、28、40 d仔鼠肾。孕鼠经0.1 g/mL水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，胚龄11 d胎鼠全胚固定，胚龄14、16、18 d胎鼠取其左肾固定；仔鼠0.1 g/mL水合氯醛麻醉后，经腹后壁取出左肾，用排刀法沿横轴将肾切开，入0.04 g/mL多聚甲醛固定，常规脱水透明，石蜡定向包埋，做厚5 μm连续切片。右肾均入液氮迅速冷冻，-85 ℃保存，供免疫印迹法测定用。

1.2试剂兔抗小鼠ADAM9多克隆抗体由上海凯博生化试剂有限公司提供；Post Vaccination(PV)兔试剂盒由中杉金桥生物技术有限公司提供；Polyvinylidene Fluoride(PVDF)膜、Bovine Serum Albumin(BSA)、Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)、Nitro-Blue-Tetrazolium/5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate(NBT/BCIP)、Tween-20、Phenylmethanesulfonylfluoride(PMSF)均由Sigma公司提供。

1.3免疫组织化学染色、灰度评分及体视学测定石蜡切片脱蜡至水后微波修复10 min，加0.3 g/mL H2O2室温孵育10 min，滴加兔抗小鼠ADAM9一抗(1∶100)4 ℃过夜，生物素标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，SABC 37 ℃孵育30 min，DAB-H2O2显色，苏木精复染。用PBS代替一抗作阴性对照。细胞质呈棕黄色为ADAM9的阳性表达。

免疫组织化学结果采用CIAS-1000细胞图像分析系统进行图像分析。每个标本取5张切片，在400倍光镜下，每张切片“S”形随机选取5个阳性视野，以切片背景色为参照，对肾小体、肾小管进行分析。以灰度值来表示ADAM9的表达量，灰度值越大，ADAM9表达量越少。

每个标本取5张切片,在油镜下按“S”形选取5个视野，采用方格测试系统，交点计数法分别测算肾小体、皮质肾小管阳性反应表达的体密度值(volume density),计算公式为Vv =ΣPX/ΣPC，其PX为测试系统落在阳性表达的肾小体或肾小管的点数，Pc为落在参照系(肾)的点数。

1.4免疫印迹法取冷冻待用的右肾组织，每组加入4倍体积裂解液，超声粉碎机粉碎后0 ℃静置30 min，离心，用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。每组样品取25 μg湿转至PVDF膜上。0.05 g/mL脱脂奶粉封闭后与ADAM9抗体(1∶400)4 ℃过夜，碱性磷酸酶标记二抗(1∶700)室温1 h，BCIP/NBT试剂显色，用Gene Tools软件分析电泳条带吸光度值(A)。

2 结 果

2.1免疫组织化学染色结果E11 d，ADAM9 即开始在输尿管芽表达(图1A)。E14 d表达在逗号小体(Ⅰ期)[6]及S小体(Ⅱ期)的裂隙中(图1B)。E16 d，在毛细血管袢阶段(Ⅲ期)表达微弱。至E18 d，在较成熟阶段(Ⅳ、Ⅴ期)的肾小体内和早期肾小管中均可见ADAM9表达，而在生肾区表达较弱。从P1 d至P7 d，在发育各期肾小体和皮质肾小管ADAM9的表达逐渐增强(图1C)，在髓质小血管可见表达(图1D)。P7 d ADAM9的表达达到高峰之后逐渐减少，但在髓放线没有表达(图1E)。P40 d生肾区消失，ADAM9仅表达于较成熟阶段的肾小体中，并趋于稳定；在成熟期的皮质肾小管ADAM9表达微弱，同时可见小动脉有阳性表达(图1F)。而其在集合管的表达始终较弱。

2.2免疫组织化学染色灰度评分结果随着肾的发育，ADAM9表达的灰度值在肾小体呈逐渐降低后趋于平稳，而肾小管则为先降低后升高的趋势(图2)。

2.3体视学测量结果随着胚(日)龄的增加，ADAM9在各期肾小体的体密度值逐渐增加，P7 d时达到最大并趋于稳定，而在皮质肾小管表达的体密度值则呈现先增后减的趋势(图3)。

2.4免疫印迹法测定结果应用Gene Tools软件对ADAM9蛋白表达的电泳条带分析显示，随着胚(日)龄的增加ADAM9在小鼠肾组织的A值呈先增后减的趋势(图4)。

图1ADAM9在小鼠肾脏组织中的表达

Fig.1 ADAM9 expression in the developing kidney detected by immunohistochemistry

A：E11 d；B：E14 d；C：P1 d；D：P7 d；E：P7 d；F：P40 d(放大倍数：E为×400，余均为×1 000)

图2小鼠不同发育阶段ADAM9在肾小体和肾小管表达的灰度值

Fig.2 Gray scale of ADAM9 in the developing renal corpuscles and tubules

与前一组比较，*P<0.05，n=200；A：肾小体的灰度值变化；B：肾小管的灰度值变化。

图3小鼠发育各阶段肾小体、皮质肾小管ADAM9阳性表达的体密度值

Fig.3 Volume density of ADAM9 in the glomeruli and tubules of developing kidneys of mice

与前一组比较，*P<0.05，n=200；A：肾小体的体密度值变化；B：肾小管的体密度值变化。

3 讨 论

ADAM9 属于跨膜蛋白家族，即去整合素(解聚素)金属蛋白酶家族(a disintegrin and metalloproteinase, ADAM)，这个家族可以通过影响细胞黏附、迁移、蛋白质水解和信号转导等，参与多种生理和病理过程。在胚胎发育中，其主要通过调控细胞与细胞、细胞与基质的粘附参与形态构建和组织形成，尤其与神经发生、细胞迁移、引导轴突生长以及细胞分化等过程密切相关[5]。研究报道在小鼠发育期的间充质、心脏和脑等部位均有ADAM9的高度表达，这提示ADAM9对多种器官的发育分化都发挥一定的作用[7]。

图4小鼠发育过程中肾内ADAM9表达的免疫印迹结果

Fig.4 Expression of ADAM9 in the developing mouse kidney detected by immunoblot

与前一组比较，*P<0.05，n=8。A：免疫印迹蛋白条带；B：ADAM9在小鼠肾组织的A值的变化。

为探讨ADAM9与肾脏发育的关系，本实验通过免疫组织化学技术结合体视学方法及免疫印迹法检测ADAM9在小鼠肾发育中的表达及其含量变化。结果发现，ADAM9在胚胎11 d时即表达于输尿管芽，这表明ADAM9在输尿管芽与生后肾组织相互诱导分支过程中，就可能发挥一定的作用。随后在各期肾小体及皮质迷路肾小管均有表达，且从生后1 d开始在肾小体和肾小管的表达都逐渐增强，生后7 d达到顶峰后肾小体的表达趋于稳定，而肾小管的表达则逐渐减弱。这说明ADAM9在肾脏发育过程中的表达具有一定的时空性，且肾小管的表达主要集中在皮质浅层，而较成熟的肾小管的表达却很弱，故我们认为ADAM9可能与肾小管的发育成熟有关。ADAM9表达于髓质小血管和成熟后小动脉，说明其在胚胎血管生成及成熟血管的维持和构建也发挥一定的作用。根据文献报道和本课题组的前期研究证明，后肾发育开始于胚胎11 d，至生后7 d时生肾区消失，肾小管和肾小体基本发育完毕，生后40 d时，小鼠肾脏与成鼠完全相同，这表明ADAM9在肾脏发育早期作用较大，而在肾脏后期的成熟过程中，作用较弱。

早在1998年，YASUSHI[8]已经证实ADAM9形成的复合物调节Pro-HB-EGF和HB-EGF(肝素结合表皮生长因子)释放，故ADAM9通过生长因子或受体蛋白水解脱落而影响细胞的发育和分化，适当的生长因子受体对于正常的胚胎发育，成体内环境的稳定是必需的。也有研究表明，ADAM9在大鼠肾脏各型去整合素金属蛋白酶表达中占支配优势，ADAM9广泛表达于肾小体，肾小管(近端、远端)的上皮细胞[9-10]，而且与含有β1链的整合素蛋白高度共表达，影响整合素与Ⅳ型胶原、层黏连蛋白以及纤维黏连蛋白的相互作用，调节细胞与细胞外基质的黏附，与多种肾脏疾病的发生发展关系密切。

综上所述，在ADAM家族中，ADAM9是一个非常活跃的蛋白酶，可以通过多种途径发挥其生理作用，尤其在肾脏发育过程中，其与细胞发育分化密切相关，然而关于这一现象的详细机制还有待于我们进一步的研究。

参考文献：

[1] ZHOU C, LIU J, LI Y, et al. microRNA-1274a, a modulator of sorafenib induced a disintegrin and metalloproteinase 9 (ADAM9) down-regulation in hepatocellular carcinoma[J]. FEBS Lett, 2011, 585(12):1828-1834.

[2] ENGLISH WR, COROVL P, MURPHY G. LPS activates ADAM9 dependent shedding of ACE from endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 421(1):70-75.

[3] PEDUTO L.ADAM9 as a potential target molecule in cancer[J]. Curr Pharm Des, 2010, 15(20):2282-2287.

[4] YAN X, LIN J, ROLFS A, et al. Expression patterns of ADAMs in the developing chicken lens[J]. J Mol Histol, 2012, 43(2):121-135.

[5] LIN J, YAN X, WANG H, et al. Expression of seven members of the ADAM family in developing chicken spinal cord[J]. Dev Dyn, 2010, 239(4):1246-1254.

[6] 金红英，田鹤，郭敏. 肝细胞生长因子受体在小鼠肾发育中的表达[J]. 解剖学杂志, 2009, 32(4):459-462.

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[10] MAHIMKAR RM, VISAYA O, POLLOCK AS, et al. The disintegrin domain of ADAM9: a ligand for multiple beta1 renal integrins[J]. Biochem J, 2005, 385(Pt 2):461-468.