张 辉 詹江华

GDNF、GFRα1和RET在先天性直肠肛门畸形中的表达及意义*

张 辉1詹江华2△

目的 探讨神经胶质细胞源性的神经营养因子（GDNF）、其受体GFRα1和原癌基因RET在先天性直肠肛门畸形肠壁组织中的表达及意义。方法收集经手术治疗的直肠肛门畸形患者12例，男8例，女4例，年龄3 d～2岁，高位无肛2例，中位无肛4例，低位无肛6例。采用免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测12例患儿肠壁盲端组织和距离盲端3 cm处的组织标本中RET、GDNF和GFRα1的表达。结果高、中、低位无肛患儿盲端标本中均缺乏神经节细胞，且RET、GDNF和GFRα1在盲端中均未见表达；距离盲端3 cm处，高、中、低位无肛组织中有神经节细胞，存在RET、GDNF和GFRα1的表达，中、低位无肛组织中呈棕褐色为强阳性，而高位无肛呈淡黄色和棕黄色为弱阳性或者阳性；术后功能随访，高位无肛中1例出现污粪，1例出现稀便不能控制，无肛门失禁情况。中、低位无肛中有1例出现直肠黏膜脱出，经坐浴肛门护理好转，1例出现排气时偶有污便，其余8例术后排便功能未见异常。结论先天性直肠肛门畸形患儿的直肠末端中神经营养因子GDNF、GFRα1和RET的低表达可能与直肠肛门畸形术后排便功能不良关系密切。

肛门闭锁；胶质细胞源性神经营养因子类；胶质细胞源性神经营养因子受体；原癌基因蛋白质cret；免疫组织化学；逆转录聚合酶链反应

先天性直肠肛门畸形术后常出现便秘和失禁，是困惑小儿外科医生的问题之一。医生时常通过改变手术方式试图达到家长满意的疗效，但往往事与愿违，手术方式改变了，但是便秘和功能不良的情况依然存在。初步研究证实，直肠肛门畸形患儿常伴随肛门周围肌肉发育异常、神经节和神经丛的减少或缺失，最终影响肠道排便功能，导致术后肛门功能不良，这些改变通常与神经营养因子关系密切[1]。目前研究较多的神经营养因子包括特异性烯醇化酶（NSE）、S-100、Cajal及神经细胞黏附因子（NCAM）等[2]。但还有一些与神经节细胞功能表达密切相关的因子，包括神经胶质细胞源性的神经营养因子（GDNF）、其受体GFRα1及原癌基因RET在直肠肛门畸形中表达的研究较少[3]。本研究通过观察直肠肛门畸形患儿直肠盲端的神经营养因子的表达，以期了解直肠盲端神经节细胞分布，以及此类神经营养因子与新肛门功能之间的关系。

1 资料与方法

1.1 病例来源 选择2009年1月—2012年12月在我院外科手术治疗的直肠肛门畸形患者12例，其中男8例，女4例，手术时年龄3 d～2岁。12例中高位2例，中位4例，低位6例。手术方式分别采用腹腔镜辅助肛门成形术，中低位无肛采用倒“Y”肛门成形术。围手术期恢复顺利，无相关合并症发生，随访结果满意。

1.2 手术标本处理 所有患者在进行肛门成形手术时，分别在直肠盲端和距离闭锁盲端3 cm处留取标本，其中新鲜标本提取RNA逆转录后行PCR检测相应神经营养因子表达；另外石蜡包埋组织切片分别检测神经节细胞分布情况，免疫组化检测各类神经营养因子在肠壁内的表达情况。

1.3 免疫组化方法 标本经中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，连续切片。免疫组化采用SP法，用已知阳性片做阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。所用RET、GDNF和GFRα1抗体为美国Zymed公司产品，工作浓度1∶50。过氧化物酶SP试剂盒及EDTA修复液购自北京中山生物技术公司。结果判定：以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达。高倍镜下随机读取每5个视野单位面积内黏膜下神经丛及肌间神经丛数目，计数神经丛内阳性细胞数目。

1.4 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 分别选取直肠盲端和距离盲端3 cm处直肠组织，采用Trizol一步法提取试剂盒（Invitrogen,Paisley,UK）提取总RNA，经RNeasy Column（Qiagen,Hilden,Germany）去除小片段，逆转录后，进行PCR。引物序列见表1。引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系25 μL，反应条件：94℃，4 min，94℃，60 s，66℃，60 s，72℃，60 s；共30个循环，后延伸72℃，10 min。PCR产物使用2%添加EB的电泳胶进行电泳。

Table 1 Primer sequences of RET,GFRα1 and GAPDH表1RET、GNDF、GFRα1及GAPDH引物序列

2 结果

2.1 手术后肛门功能随访结果 本组患者均获得随访，术后随访3个月～4年。2例高位无肛患者中1例出现污粪，1例出现稀便不能控制，无肛门失禁情况。中、低位无肛患者中1例出现直肠黏膜脱出，经坐浴肛门护理好转，1例出现排气时偶有粪便排出情况。其余8例术后排便功能未见异常。

2.2 GDNF、GFRα1和RET蛋白表达 HE染色显示无论是高位、中位和低位无肛，直肠盲端均未见神经节细胞，而在距离直肠盲端3 cm处取材的组织中可见神经节细胞，只是细胞数量不同。低位和中位无肛距离直肠盲端3 cm处可以见到数量和形态均正常的神经节细胞，而高位无肛有神经节细胞，但是神经节细胞数量少、形态小。

免疫组化染色显示患者直肠盲端组织中均未见3种蛋白表达；距离直肠盲端3 cm处组织中可见3种蛋白表达，中、低位无肛3种神经营养因子的表达呈棕褐色为强阳性（+++），而高位无肛呈淡黄色和棕黄色为弱阳性或者阳性（+～++），见图1；与神经节细胞的分布情况相一致。

2.3 RT-PCR结果 低位、中位和高位肠壁组织中存在内参GAPDH的表达，GDNF、GFRα1、RET均是低位无肛表达最高，中位无肛表达次之，高位无肛表达最低，见图2。

3 讨论

目前先天性直肠肛门畸形是小儿外科比较常见的先天性发育畸形，文献报道在新出生婴儿中其发病率为1/1 500～1/5 000[4]。肛门直肠畸形的种类繁多，病理改变复杂，不仅肛门直肠本身发育缺陷，肛门周围肌肉-耻骨直肠肌、肛门外括约肌和肛门内括约肌均有不同程度的改变，肠道神经系统改变也是重要病理改变。肠壁内神经节细胞的发育依赖其神经营养因子的支持和维护[5]。研究证实，在直肠肛门畸形肠壁组织中缺乏NSE、S-100和C-kit表达与肛门功能关系密切[2]。但是与神经节细胞发育、迁移、定植功能密切相关的GDNF、GFRα1、RET的功能表达尚少见报道。RET和GDNF是肠道神经节细胞发育最重要的营养和信号传输系统，其存在预示神经节细胞可能在胚胎期发育成熟。如表达缺失则可能伴有神经节细胞的发育过程受阻，引起其定植、迁移和成熟过程受阻。

Figure 2 PCR results of GDNF,GFRα1and RET transcription in tissue of congenital imperforate anus图2 GDNF、GFRα1和RET在先天性直肠肛门畸形肠组织的PCR结果

GDNF及其家族是属于糖蛋白，与RET结合紧密，本身具有独特的信号传输途径[6]。GDNF可抑制由RET基因引起的神经细胞凋亡，且这一抑制过程在RET基因的5种突变中均可见到。GDNF是神经营养因子，在体外研究中可见GDNF有促进神经节细胞存活的作用。GFRα有4种形式，包括GFRα1～4，分别有相应的受体。目前考虑，不仅GDNF/RET在肠道神经节细胞发育过程中有关键的作用，而且GDNF/GFRα1也具有非常重要的作用。在敲除RET后，可见GDNF单独激活感觉神经元的活性；同样在RET基因缺失表达情况下，有GFRα1表达时，GDNF可以促进神经元的存活，说明GFRα1、GDNF可能还有另外一条途径来影响神经节细胞发育过程[7]，有待进一步深入研究。所有GDNF参与的过程均可见GFRα1表达，提示GDNF和GFRα1不断释放激动信号，通过RET基因传递到神经节细胞内，以维持神经节细胞的存活、发育和移行过程。本研究结果证实，在有神经节细胞存在的肠壁内，均存在GDNF、GFRα1、RET表达。

Maurício等[8]研究显示ARM小鼠模型可见肠道末端神经节细胞密度降低，且功能表达也有所降低；在术中保留的肠管末端是否存在神经节细胞发育不良或神经节细胞缺乏，与其预后密切相关。肠道组织活检病理检测神经节密度、神经节大小、神经细胞数量及大小可以客观反映肠道功能，评价术后生存质量[9]。根据直肠末端神经节细胞及神经丛残留情况，可以估计保留肠管是否具有正常肠道功能，是否支持患儿术后肠道正常运动，以指导术式选择、肠管保留，并对评价患儿预后具有重要作用[10]。

本组研究结果显示中、低位无肛肠壁中神经节细胞相关的神经营养因子的表达高于高位无肛组织，RT-PCR结果亦得出同样结论，提示患儿神经节细胞的先天发育存在异常。在高位无肛患儿肠壁内发育成活的神经节细胞数量少、形态小。RET、GDNF、GFRα1在肠壁内的表达情况与神经节细胞的分布情况相对应，有神经节细胞存在的肠壁内，免疫组化染色呈现阳性表达，而在直肠末端其表达明显减低，推测在肠壁内RET、GDNF、GFRα1的表达情况与其神经节细胞分布多少成正比。中、低位无肛神经营养因子的表达明显好于高位无肛；结合临床的随访结果，提示直肠末端神经营养因子的低表达可能与直肠肛门畸形术后排便功能不良关系密切。高位无肛术后肛门功能不良与神经营养因子的分布降低是否有关还需大样本研究来证实。在高位无肛的手术过程中，应注意结合临床和病理检查结果决定保留其直肠末端的肠管组织，以便术后获得良好的直肠肛门功能。

Figure 1 Protein expressions of GDNF,GFRα1 and RET图1 GDNF、GFRα1和RET蛋白表达（SP染色，×400）

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（2013-11-04收稿 2014-04-17修回）

（本文编辑 李国琪）

Clinical Significance of GDNF/GFRα1/RET Expression in Distal Rectum with Congenital Anorectal Malformation

ZHANG Hui1,ZHAN Jianghua2
1 Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Department of Surgery, Tianjin Children’s Hospital

Objective To evaluate the significance and expression of the GDNF/GFRα1/RET genes in distal rectum with Congenital Anorectal Malformations(ARMs)MethodsSpecimens were collected from resected colon which is 3 cm away to the anus and the distal of rectum in 12 ARMs patients.Haematoxylin and Eosin(HE)staining,immunohistochemical (IHC)staining and reverse transcription PCR(RT-PCR)were used to test RET,GDNF and GFRα1 expression in the different site of samples with ARMs.ResultsExpression of ganglia and RET,GDNF and GFRα1 were all negative in distal rectum in 12 ARMs patients.Ganglionic cells were found in tissues 3 cm away from the anus where RET,GDNF and GFRα1 expression were also positive in those ARMs patients.Expression of RET,GDNF and GFRα1 were strong positive in middle and low imperforate anus indicated by brown color and week positive in high imperforate anus indicated by yellow color.One case of faeces contamination and one case of loose motion without anal incontinence were found in post-op follow up of high ARMs patients.By contrast,one case of rectal mucosa prolapse and one case of occasional faeces contamination which recovered with hip bath were found in post op follow up in middle or low ARMs.ConclusionThe unsatisfactory anorectal function is possibly related to the decrease or lost of neurotrophic factors(GDNF/GFRα1/RET)and ganglia in the myenteric plexuses post plastic surgery in ARMs patients.

anus imperforate;glial cell line-derived neurotrophic factors;glial cell line-derived neurotrophic factor receptors;proto-oncogene proteins c-ret;immunohistochemistry;reverse transcriptase polymerase chain reaction

R657.11

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.023

*天津市科委计划项目（项目编号：10JCYBJC11400）

1天津医科大学研究生院（邮编300070）；2天津市儿童医院普外科

△通讯作者 E-mail:zhanjianghuatj@163.com