李 明，金 刚，朱俊义，徐 晶

(1.通化师范学院 制药与食品科学学院，吉林 通化 134002；2.修正药业集团股份有限公司；3.通化师范学院 生命科学学院，吉林 通化 134002)

大叶子(Astilboides tabularis)别名大脖梗子、山荷叶,多年生草本，分布于吉林长白山和辽宁，生于海拔1000m左右的林下．朝鲜半岛也有分布．大叶子可食，民间常作为山野菜食用，且有收涩、固肠、止泻的功效．中药化学成分为无色飞燕草素、无色矢车菊素、槲皮素、没食子酸[1]．大叶子是一种极具开发潜力的药食两用植物．迄今为止，国内对大叶子的研究还未见报道．本文主要研究大叶子总黄酮提取的最佳工艺，以期为大叶子在保健食品开发方面的研究提供依据．

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

大叶子，采集自吉林长白县，经通化师范学院于俊林教授鉴定为大叶子；芦丁标准品，中国固体制剂制造技术国家工程中心．亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、乙醇等试剂均为分析纯．天平、真空干燥箱、粉碎机、水浴锅、循环水式真空泵、可见分光光度计、超声波清洗仪．

1.2 方法

(1)原料处理．工艺流程：原料选取→清洗→烘干→粉碎．选取大叶子鲜品，清洗后在真空干燥箱中烘干，粉碎．

(2)总黄酮提取．工艺流程:大叶子干粉→加乙醇超声提取→乙醇回流提取→过滤→测定总黄酮含量．准确称取处理好的原料粉末2g于烧瓶中，加入浓度50%的乙醇溶液95mL，在500 W、40 KHz条件下超声提取5min后，在80℃水浴中加热回流30min后抽滤，定容至100mL．

(3)总黄酮含量测定[2]．精密吸取0.l mg/mL的芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加30%乙醇使成5mL．先加5%的NaNO2溶液0.3mL，混匀后放置6min；再加10%的AI(NO3)3溶液0.3mL，摇匀后放置6min;最后加4%的NaOH溶液4mL，用蒸馏水稀释到10mL，摇匀，放置15min，以第一管为空白，在510nm波长处测定吸光度值，以吸光度值为横坐标，芦丁对照品溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线．从100mL提取液中精密吸取lmL该溶液置于10mL容量瓶中，加30%乙醇使成5mL，以下步骤同标准曲线制作测定提取液中总黄酮含量．

(4)超声提取单因素试验设计．准确称取处理好的原料粉末各2g于烧瓶中，加入浓度为50%的乙醇溶液95mL，在500W、40KHz条件下超声提取5、10、15、20、30、35min后，在80℃水浴中加热回流30min后抽滤，定容至100mL．

(5)总黄酮回流提取单因素试验设计．①乙醇浓度对得率影响．准确称取处理好的原料粉末各2g于烧瓶中，分别加入浓度为10、30、50、70、90%的乙醇溶液各80mL，在80℃水浴中加热回流30min后抽滤，定容至100mL．②提取温度对得率影响．准确称取处理好的原料粉末各2g于烧瓶中，加入浓度为50%的乙醇溶液80mL，分别在50、60、70、80、90℃水浴中加热回流30min后抽滤，定容至100mL．③料液比对得率影响．准确称取处理好的原料粉末各2g于烧瓶中，分别用50%的乙醇以物料比为1:20、l:30、l:40、1:50、1:60混合，在80℃水浴中加热回流30min后抽滤，定容至100mL．④提取时间对得率影响．准确称取处理好的原料粉末各2g于烧瓶中，加入浓度为50%的乙醇溶液80mL，在80℃水浴中加热回流20、40、60、80、100min后抽滤，定容至100mL．⑤总黄酮提取正交试验设计．以单因素试验为基础，选取乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间四项作为考察因素，各取三个水平，进行L9(34)正交试验设计，以确定大叶子提取的最佳工艺条件，方案见表1．

表1 正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 芦丁标准品溶液的标准曲线

采用二元线性回归法得到吸光度OD值与芦丁标准品浓度mg/mL之间的回归方程为y=22.31x，r2=0.996，标准曲线如图1所示．

图1 芦丁标准品溶液的标准曲线

2.2 超声单因素提取试验结果与分析

由图2可知，得率随时间延长而增加，但超过15min后得率开始下降，原因可能是超声时间太长会破坏黄酮类化合物的结构，导致得率下降．

图2 超声时间对得率影响

2.3 回流提取单因素试验结果与分析

(1)乙醇浓度对得率影响．由图3可知，乙醇浓度在50%时，总黄酮得率最高，故选择50%乙醇提取较合适．

图3 乙醇浓度对得率影响

(2)提取温度对得率影响.由图4可知，随温度的升高，得率也在升高，90℃得率最高，但从80℃开始曲线趋于平缓，从能源角度考虑选择90℃较合适．

图4 提取温度对得率影响

(3)料液比对得率影响.由图5可知，随料液比的增加，得率也在升高，1:60时得率最高．曲线从1:50开始趋于平缓，故从节约溶剂角度考虑料液不宜选择过大，1:60较合适.

图5 料液比对得率影响

(4)提取时间对得率影响．由图6可知，随提取时间的延长，得率也随之升高，100min时得率最高．但从80min开始曲线趋于平缓，时间的延长对提高得率的影响不大，故选择100min较合适．

图6 提取时间对得率影响

2.4 正交试验优化结果与分析

以大叶子总黄酮得率为指标，选定四因素三水平进行正交试验(见表2)．由表2可知，影响大叶子总黄酮提取因素的主次顺序为时间、乙醇浓度、料液比、提取温度．最优组合为A3B3C2D1，即乙醇浓度70%、提取温度90℃、料液比1:60、时间80min，得率为2.53%．

表2 正交试验结果

参考文献：

[1]谢宗万,余友芩.全国中草药名鉴[M].北京:人民卫生出版社,2000.

[2]李良导.皱皮柑果皮中总黄酮的提取、纯化及初步鉴定[D].长沙:湖南农业大学,2008.