刘芳利 罗彬 孙敬武 陈浩

γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid ，GABA )是成年哺乳动物中枢神经系统中最为广泛和重要的抑制性神经递质，它与大多数中枢神经系统的活动密切相关。既往大量实验研究[1～3]指出，外周听器损伤、老年性聋、药物性聋或耳鸣、噪声暴露导致听觉功能变化后,中枢听觉系统中GABA的功能都会发生变化。中枢神经系统中GABA主要来源于谷氨酸的脱羧基作用,其主要限速酶为谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)，GAD有GAD65和GAD67两个亚型，它们在整个神经元中均有分布，GAD65主要分布于神经末梢，而GAD67主要位于胞体。大多数GAD65以不太活跃的脱辅基酶的形式存在[4～6]，而GAD67的辅基则已饱和，在反应中非常活跃，因此，GAD67作为观测GABA水平变化的指标更加敏感。

听皮层是听觉信息识别、整合和处理的基础，是中枢听觉系统的重要组成部分。同时，听皮层是听觉传导通路神经元数量最多的部位之一[7]。因此，与听觉相关的蛋白质在听皮层的表达量在整个听觉传导通路中具有一定的代表性。本研究拟通过观察噪声暴露后大鼠听性脑干反应(ABR)及听皮层GAD67阳性神经元数量的变化，初步探讨噪声性听损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选用2～4月龄、体重200～250 g健康雌性SD大鼠21只为实验动物(由安徽医科大学动物中心提供)，所有动物耳廓反射正常，耳镜检查未见明显异常，无耳毒性药物史及强噪声暴露史，实验前双耳ABR反应阈在25 dB SPL以内。将大鼠随机分成 0、7、14天组，每组7只，并分别标记，每组大鼠再随机分为对照组(3只)和暴露组(4只)。

1.2实验方法

1.2.1噪声暴露动物模型的建立 所有暴露组动物于清醒状态下，在隔声室内置入专用器皿，扬声器距离大鼠头部25 cm，双耳暴露于频率为4 kHz以上、100 dB SPL白噪声2小时。声音由软件Adobe audition3，Version 3 生成，由MATRX M-640功放系统(杭州奥斯通)控制,CP-75A扬声器(上海创木)给声。

1.2.2ABR检测 所有实验动物于噪声暴露前测试ABR，暴露组大鼠再于暴露后0天(0.5～2小时)、第7天、第14天测试ABR，对照组大鼠于各暴露组对应时间分别检测ABR。各组动物经腹腔注射7%的水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后，用TDT系统(包括模块ED1，PA5，RP2，RA16，美国TDT公司)检测ABR。测试电极置于两耳连线水平头顶正中，接地电极置于大鼠鼻尖，参考电极置于对侧乳突。刺激声采用click声，间隔为10次/秒，以开放声场给声，扬声器(ESN SN 3389，美国TDT公司)距离大鼠测试耳外耳门1 cm。滤波范围100～3 000 Hz，平均叠加1 000次。ABR波形采用美国TDT公司的BioSigRP记录、分析，以能引出波Ⅲ的最小刺激强度为大鼠ABR反应阈。

1.2.3听皮层GAD67表达量检测 各组大鼠分别于暴露后0天(2～4小时内)、第7天、第14天完成ABR测试后，于水合氯醛深麻醉下，先予PBS 100 ml、 4%多聚甲醛300 ml行心脏灌注后取脑组织，4%多聚甲醛后固定后冰冻切片机(CM 1950，德国Leica)冠状位连续切片，片厚30 μm。按照大鼠脑组织立体定位图谱，每只大鼠随机取5张含听皮层脑片进行染色。漂片法行GAD67阳性神经元标记，一抗为鼠抗GAD67单克隆抗体(ab26116，英国ABcam)，二抗来自通用型免疫组化试剂盒(SP-9001，北京中杉)。DAB法染色，材料为浓缩型DAB试剂盒(ZLI-9017，北京中杉)。免疫组化图像用光学显微镜(Axioskop 2 plus，德国Zeiss)观察，用Axiovision图像系统采集图像。采集图像范围：在含听皮层的脑片上，嗅沟向上1 mm处，10倍目镜下，由听皮层表面向内取连续的3个20倍物镜视野，观察GAD67染色阳性神经元，用每平方毫米(mm2)听皮层平均阳性神经元数量表示GAD67水平。

1.3统计学方法 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠ABR反应阈 由表1可见，暴露组大鼠噪声暴露后各时间点ABR反应阈较暴露前均有提高，最高达39.58±8.10 dB SPL，噪声暴露后0～14天其听力逐渐恢复，ABR反应阈呈下降趋势，到第14天时平均为21.25±4.78 dB SPL。暴露后0天(0.5～2小时)暴露组ABR反应阈较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，第7、14天时暴露组与对照组ABR反应阈差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 暴露组与对照组噪声暴露前后ABR反应阈比较(dB SPL)

注：*与对照组相比，P<0.01

2.2各组听皮层GAD67表达阳性神经元数量 对照组与暴露组听皮层中均有GAD67表达阳性的神经元(图1)。各组噪声暴露后不同时间听皮层GAD67表达阳性的神经元计数见表2，可见，噪声暴露后0天(2～4小时)暴露组大鼠听皮层GAD67表达阳性神经元的数量比对照组明显升高(P<0.01)，第7天和第14天暴露组GAD67阳性神经元数量均明显低于对照组(P<0.05)。

图1 暴露后不同时间免疫组化染色结果

图中箭头示GAD67阳性神经元。暴露后0天暴露组GAD67阳性神经元数目(b)明显多于对照组(a)，暴露后14天时GAD67阳性神经元数目(d)低于同期对照组(c)

表2 各组大鼠噪声暴露后听皮层GAD67阳性神经元数量(个/mm2)

注：与对照组比较，*P<0.01,**P<0.05

3 讨论

近年来对噪声暴露的强度、频率、持续时间与听觉器官受损范围及程度的关系有较多研究，Abbott等[8]将大鼠暴露于10 kHz、100 dB强声9小时, 观察到动物的各频率ABR反应阈均提高25～30 dB SPL，30天后除了10～20 kHz外，其它频率ABR反应阈均与对照组差异无统计学意义；有研究者将南美栗鼠暴露于中心频率为4 kHz的倍频带、86 dB SPL的噪声中24小时，暴露后所有动物在4～12 kHz ABR反应阈平均提高43 dB SPL，短时间内部分动物ABR反应阈完全恢复，而部分动物某些频率ABR反应阈在观察期内持续升高，个体差异明显[9]；Cherylea[10]将大鼠单耳暴露于中心频率16 kHz、1/10倍频、115 dB SPL噪声中1小时，暴露后所有动物均有ABR反应阈的升高，第8天时除了某些高频ABR反应阈持续升高外，低频基本恢复正常，而到32天时动物各频率ABR反应阈再次升高；Pouyatos等[11]将大鼠暴露于8 kHz、97 dB SPL的噪声6小时/天，每周5天，持续 4 周后动物ABR反应阈平均提高27 dB SPL,短期内ABR反应阈未恢复；Turner等[12]给予动物同样的噪声暴露后，经过4个月的恢复时间各频率ABR反应阈依然很高；Bauer[13]给予动物16 kHz、105 dB SPL的声刺激1小时，观察到7个月后其ABR反应阈仍高于正常，而另有作者观察到大鼠暴露于中心频率为17 kHz倍频带、116 dB SPL噪声1小时，16周后听力完全恢复[14]。上述研究结果的多样性可能与实验动物的个体差异、噪声暴露的性质、研究者的不同研究目的有关，但这些研究的共同点是噪声暴露未导致受试动物听觉的完全丧失，多数动物ABR反应阈提高的程度在30 dB SPL以内，其中大部分研究证明噪声暴露导致16 kHz和32 kHz的听力损失最严重。

本研究结果显示，大鼠暴露于频率4 kHz以上、100 dB SPL白噪声中2小时后其ABR反应阈较暴露前明显提高，这与大部分学者的结果相符；噪声暴露后14天时，大鼠的ABR反应阈与对照组比较差异无统计学意义，说明此种性质的噪声导致了大鼠听力的暂时性阈移。噪声暴露导致听觉功能受损的因素很多，而外周听器中的组织结构及功能变化包括：柱状体的屈曲膨胀、外毛细胞的静纤毛与柯替氏膜解耦和[9]、毛细胞静纤毛的损伤，耳蜗内电位的抑制和邻近传入神经的损伤等。目前，大部分学者认为哺乳动物损失的毛细胞及传入神经损伤后不能自主再生，可能与永久性阈移的发生相关，而柱状体的形态改变、毛细胞与柯替氏膜之间的功能改变以及耳蜗内电位的抑制在经过短时间的休息后则能恢复正常，这几种改变可能是暂时性阈移的主要原因，由此推论，本研究中噪声暴露后大鼠外周听器的变化可能局限于后几种结构改变。

大量的研究证明机体承受急性压力和刺激后将出现GAD67水平的迅速升高。Bowers等[15]发现急性应激反应将引起神经传导通路中GAD67水平明显升高，而这种变化同样出现在大脑皮质的局部缺血后[16]。也有学者指出小脑传入神经受刺激后可增加GAD67的mRNA表达，提高了其活性[17]。Abbott等[8]用蛋白质印迹和免疫组化两种方法检测噪声暴露结束后大鼠的下丘GAD67的表达，发现其表达量明显升高。本研究也显示噪声暴露后2～4小时内大鼠的听皮层GAD67表达阳性的神经元数量明显增多。有学者提出GAD67的升高可能与GABA的新陈代谢活跃程度相关[18]，强噪声刺激会导致下丘中新陈代谢变化，GABA代谢活跃,可能是GAD67在噪声暴露后早期增多的原因。另外，亦有学者通过免疫组化的方法对猫的视觉系统中GAD表达及分布进行研究，提出对于外界刺激GAD67可能参与了一个相对滞后但更复杂的反应[19]，但不论其机制如何，噪声暴露后早期GAD67的升高都反映了机体对于外界不良刺激做出的反应。

在Abbott[8]的试验中，在声暴露结束后2天下丘中GAD67水平即从升高恢复到正常，而到第30天时仅为对照组的21%。Cherylea[10]观察到大鼠单耳噪声暴露后，对侧下丘和背侧耳蜗核中GAD67的表达先轻度升高，随后降低，并在足够长时间后恢复到正常水平。除此之外还有很多实验证明在噪声暴露后下丘的抑制功能减弱[18,20～23]。从文中结果看，在噪声暴露后第7天和第14天时，大鼠听皮层中GAD67的量较对照组明显降低，与既往试验中听觉系统其它部位的抑制功能相关蛋白质的变化规律一致，这可能是由于噪声暴露造成了外周听觉系统及神经末梢的损害，甚至导致传入神经阻滞和神经传导通路中选择性的损伤，从而使噪声暴露停止后兴奋性信号传入减少；机体为达到一种稳态，对抑制性神经递质GABA的释放也减少，因此，对GAD67需求量也减少，导致观察部位GAD67阳性神经元数量的减少；而噪声暴露后听觉系统中GABA和GAD67水平的降低，会导致神经自发电活动、同步性和兴奋性的增加[24,25]，这可能与噪声暴露后耳鸣的发生机理有关。

综上所述，大鼠于频率4 kHz以上、100 dB SPL白噪声中暴露2小时后可出现听觉功能受损，ABR反应阈发生了暂时性阈移，且听皮层GAD67表达阳性的神经元数目先增多后减少，直到暴露后第14天时仍低于对照组，提示听皮层内抑制性神经递质GABA在噪声暴露后短时间内升高，此后逐渐降低，直至观察期结束仍处于较低水平，这可能是噪声性聋、耳鸣及其它听觉功能异常的发病机制之一。

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