马海珠 钟时勋 温雅

梅尼埃病是一种慢性水代谢性内耳疾病，目前普遍认为该病的组织病理学特征为内淋巴积水，为内淋巴液过度分泌和/或吸收障碍引起内淋巴液稳态失衡所致[1，2]。Takeda等[3]发现梅尼埃病患者的血浆精氨酸加压素(arginine vasopressin, AVP)水平比其他原因所致眩晕的患者明显增高，豚鼠皮下埋置微泵，持续小剂量注入AVP后发现豚鼠耳蜗底回、中回以及顶回轻-中度内淋巴积水[4]，由此推测内淋巴积水可能与血浆AVP的异常分泌有关。水通道蛋白2(aquaporin 2，AQP2)表达于肾、耳蜗[5]、内淋巴囊上皮[2]、脑以及睾丸[5]等组织，是唯一对AVP敏感的蛋白通道，AVP上调肾脏集合管主细胞顶侧膜AQP2的表达，促进集合管腔水的重吸收。然而，AVP对耳蜗AQP2表达的调节及机制尚未完全阐明。本研究拟通过腹腔注射AVP的V2受体激动剂醋酸去氨加压素(deamino arginine vasopressin, DDAVP)构建内淋巴积水豚鼠模型[6]，分析DDAVP对豚鼠耳蜗AQP2的分布与表达的影响，探讨AQP2参与内淋巴积水的形成机制，为治疗梅尼埃病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 40只普通级健康雄性成年豚鼠(重庆医科大学实验动物中心提供，动物管理符合重庆市实验动物管理规定)，体重200～250 g，活动敏捷，无噪声暴露及药物使用史，耳廓反射灵敏。随机分为实验组和对照组，每组各20只。

1.2实验方法

1.2.1实验材料 DDAVP购自美国Sigma公司；AQP2兔抗鼠多克隆抗体购自美国Santa Crus公司；兔鼠通用型SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2.2构建内淋巴积水豚鼠模型 实验组腹腔注射DDAVP 4μg·kg-1·d-1，共7天，构建内淋巴积水模型；对照组每日给予相同剂量的生理盐水腹腔注射，共7天。

1.2.3耳蜗及肾脏切片HE染色[6]停药7天后，随机抽取实验组和对照组豚鼠各5只(10耳)，全身麻醉下进行心脏灌注后断头，打开听泡，修剪耳蜗周围骨质，将耳蜗置于4%多聚甲醛固定48小时，10%EDTA脱钙液(pH 7.0～7.2)在4℃下脱钙3周，梯度酒精逐级脱水，石蜡包埋，平行蜗轴连续切片，片厚4 μm。取出肾脏，固定，常规石蜡包埋，切片，常规HE染色。运用Image-Pro Plus 6.0软件测定耳蜗切片各回中阶和前庭阶横截面积，计算中阶与中阶加前庭阶横截面积和的比值，取平均值R代表内淋巴积水程度[6]。

1.2.4免疫组化染色 将上述切片按照SP免疫组化试剂盒说明书操作，一抗为AQP2兔抗鼠多克隆抗体，PBS代替一抗作为阴性对照，肾脏切片为阳性对照。免疫组化染色棕色颗粒为AQP2染色的阳性标志，用Image-Pro Plus 6.0软件计算平均光密度值(OD值)。

1.2.5蛋白印迹法 将两组剩余豚鼠各15只(30耳)全身麻醉，断头取出听泡，骨镊剔除骨性外壁，保留耳蜗软组织，以3对耳蜗(6耳)作为一组，提取蛋白，12%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，一抗为AQP2兔抗鼠多克隆抗体，β-actin为自身对照，肾脏为阳性对照。运用Quantity One软件计算AQP2与β-actin蛋白条带的灰度值比值，以该比值作为AQP2蛋白相对表达量进行半定量比较。

1.3统计学方法 所有数据均使用SPSS19.0统计软件进行独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1内淋巴囊积水模型评估 两组豚鼠的肾脏组织未见明显充血水肿。实验组豚鼠(5只，10耳)耳蜗切片HE染色显示前庭膜向前庭阶膨隆，且底回较顶回更明显，部分前庭膜破裂，均表现为不同程度的内淋巴积水，耳蜗切片显示造模成功率为100%；对照组豚鼠(5只，10耳)耳蜗前庭阶、鼓阶等组织结构正常，鼓阶面积约为前庭阶面积的二分之一，均无明显内淋巴积水(图1)。实验组和对照组R值分别为0.42±0.04和0.31±0.03，实验组内淋巴积水程度重于对照组(P<0.05)。

2.2实验组与对照组豚鼠耳蜗AQP2表达部位及OD值比较 实验组和对照组豚鼠耳蜗组织中均有AQP2表达(图2)，表达部位均位于血管纹、螺旋神经节细胞。实验组和对照组血管纹AQP2表达的平均OD值分别为0.1611±0.0037和0.1356±0.0108，实验组高于对照组(P<0.05)。

2.3实验组与对照组耳蜗AQP2表达半定量比较 蛋白印迹法结果显示实验组与对照组耳蜗均有AQP2表达(图3)。以β-actin的表达作为自身对照，将AQP2与β-actin蛋白条带灰度值的比值作为AQP2蛋白相对表达量进行半定量比较，实验组和对照组AQP2蛋白相对表达量分别为0.9554±0.0498和0.7664±0.1452，实验组耳蜗AQP2的蛋白表达高于对照组(P<0.05)。

3 讨论

目前，国内外构造内淋巴积水动物模型的方法有很多，最常用的经典方法为手术栓塞内淋巴囊法，也有人用激素诱导法和免疫毒素法。本实验采用腹腔注射DDAVP法[6]建模，成功诱发豚鼠内耳内淋巴积水，该方法较手术法操作简单易行，观察周期短，较其他造模方法成功率高，可行性强。从文中结果看，豚鼠内耳底回积水较顶回明显，考虑可能为耳蜗底回螺旋韧带等膜迷路组织表面积大于顶回，其所包含的与AVP作用的酶及受体相对较多有关。天然AVP的长效衍生物DDAVP为AVP的V2受体激动剂，特异性作用于V2受体，强化了抗利尿作用，延长了作用时间，减轻了升压作用，排除了实验动物因血压升高等病理改变对结果的干扰；文中结果间接表明AVP可以通过作用于V2受体诱导内淋巴积水。

图1 两组豚鼠耳蜗内淋巴积水(HE ×100) a 实验组，b 对照组

图2 两组豚鼠血管纹及螺旋神经节AQP2表达(DAB染色 ×200)

图3 蛋白印迹法检测两组豚鼠耳蜗AQP2蛋白表达

左侧为实验组，右侧为对照组，两组豚鼠耳蜗均有AQP2蛋白的表达(28 kDa)，β-actin作为内参照(42 kDa)

目前，关于AQP2在耳蜗的表达部位众说纷纭。Mhatre等[5]通过免疫组织化学染色方法发现在成年大鼠和小鼠AQP2表达于内耳内淋巴周围的组织，包括Reissner膜、Corti器、内外沟细胞，而血管纹未见表达。Merves[7]发现AQP2表达于小鼠内耳的Reissner膜、Corti器和血管纹。本研究发现AQP2表达于豚鼠耳蜗的血管纹、螺旋神经节细胞，与国内学者韩红蕾等[6]研究结果相似。推测耳蜗AQP2的表达差异与动物种属差异有关，也可能与不同的实验方法有关。

Sawada[8]给予大鼠大剂量AVP(50 μg/kg)，发现大鼠耳蜗AQP2 mRNA表达显著增加，本研究结果显示给予DDAVP后，豚鼠耳蜗中AQP2表达强度高于正常豚鼠，组织学特征为内淋巴积水，提示DDAVP可上调豚鼠耳蜗AQP2的表达诱发内淋巴积水。Nishioka[9]发现在大鼠内耳中AVP上调AQP2及V2受体表达，同时免疫电镜显示血管纹中AQP3和V2受体表达于基底细胞的顶侧膜，AQP2定位于底侧膜，这与其在肾脏的分布方式相同，因此推测AQP2、AQP3和V2受体在血管纹中的作用机制与在肾脏中相同，水分子经血管纹基底细胞底侧膜上AQP2水通道从外淋巴流入基底细胞，通过基底细胞顶侧膜上AQP3水通道进入内淋巴，实现内、外淋巴液的动态平衡，共同维持内耳正常的听觉和前庭功能[1]。结合本研究结果及文献报道，推测DDAVP诱发内淋巴积水的机制可能为DDAVP通过螺旋动脉结合血管纹基底细胞顶侧膜上V2受体，上调血管纹底侧膜上AQP2的表达，增加基底细胞底侧膜上AQP2分布的密度，促进水经AQP2水通道从外淋巴流入基底细胞，通过基底细胞顶侧膜的AQP3进入血管纹细胞外液，导致内淋巴液过度分泌，诱发内淋巴积水。Nishimura[10]使用透射电镜实时检测发现腹腔注射VP可诱发内淋巴积水，而V2受体特异性拮抗剂可抑制该作用；Maekawa[11]发现V2受体特异性拮抗剂和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)特异性拮抗剂可阻滞AVP对AQP2的调控作用，而腺苷酸环化酶激活剂可产生与AVP类似的作用。因此，推测DDAVP通过V2受体-cAMP-PKA途径作用于AQP2，然而更为具体明确的机制仍有待进一步研究。

在肾脏集合管主细胞中，AQP3与V2受体位于底侧膜，AQP2位于顶侧膜，DDAVP上调AQP2的表达，位于肾脏的集合管主细胞胞质内富含AQP2的囊泡通过胞吐移位于顶侧膜，且提高AQP2的活性，进而提高水通透性，增加从集合管腔重吸收至主细胞胞质的水分，促进肾脏重吸收；但在耳蜗组织，DDAVP上调血管纹AQP2表达，促进血管纹分泌内淋巴液，导致内淋巴积水；这表明AQP2介导水转运具有方向性，可能是因为它在耳蜗血管纹和肾脏集合管上皮表达方向相反所致，具体机制仍有待进一步研究。

4 参考文献

1 Andreas E, Corinna G, Heinz A, et al. Water channel proteins in the inner ear and their link to hearing impairment and deafness[J].Molecular Aspects of Medicine, 2012, 33: 612.

2 Takeda T, Taguchi D. Aquaporins as potential drug targets for Meniere's disease and its related diseases[J].Handb Exp Pharmacol, 2009, 190: 171.

3 Kitahara T, Maekawa C, Kizawa K, et al. Plasma vasopressin and V2 receptor in the endolymphatic sac in patients with delayed endolymphatic hydrops[J].Otology & Neurotology, 2009, 30: 812.

4 Takeda T, Takeda S, Kitano H, et al. Endolymphatic hydrops induced by chronic administration of vasopressin[J].Hear Res, 2000, 140: 1.

5 Mhatre AN, Jero J, Chiappini I, et al. Aquaporin-2 expression in the mammalian cochlea and investigation of its role in Meniere's disease[J].Hear Res, 2002, 170: 59.

6 韩红蕾, 张连山, 顾凤明. 正常和膜迷路积水豚鼠内耳水通道蛋白的表达及意义[J].听力学及言语疾病杂志, 2010, 18: 363.

7 Merves M, Bobbitt B, Parker K, et al. Developmental expression of aquaporin 2 in the mouse inner ear[J].Laryngoscope, 2000, 110: 1 925.

8 Sawada S, Takeda T, Kitano H, et al. Aquaporin 2 regulation by vasopressin in the rat inner ear[J].Neuroreport, 2002, 13: 1 127.

9 Nishioka R, Takeda T, Kakigi A, et al. Expression of aquaporins and vasopressin type 2 receptor in the stria vascularis of the cochlea[J].Hear Res, 2010, 260: 11.

10 Nishimura M, Kakiqi A, Takeda T, et al. Time course changes of vasopressin-induced enlargement of the rat intrastrial space and the effects of a vasopressin type 2 antagonist[J].Acta Otolaryngol, 2009, 129: 709.

11 Maekawa C, Kitahara T, Kizawa K, et al. Expression and translocation of aquaporin-2 in the endolymphatic sac in patients with Meniere’s disease[J].Neuroendocrinol, 2010,22:1 157.