祝 平 郭莲怡

土槿乙酸对人肝癌细胞中血管内皮生长因子表达的影响

祝 平 郭莲怡△

目的探讨土槿乙酸（PAB）对人肝癌细胞BEL-7402中血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法以0（对照组）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L PAB处理人肝癌细胞BEL-7402，培养6 h，0.4%台盼蓝染色，在显微镜下观察并计算细胞活率。采用WST-8法检测细胞增殖，RT-PCR法检测人肝癌细胞BEL-7402中VEGF mRNA表达，Western Blot检测VEGF蛋白表达。结果不同剂量PAB处理的人肝癌细胞BEL-7402的细胞增殖率与对照组比较差异无统计学意义。随着PAB浓度的增加，VEGF mRNA表达与对照组（2.53±0.07）相比分别降低至1.90±0.02、1.31± 0.03、0.86±0.04、0.60±0.03、0.34±0.02，差异有统计学意义（P＜0.01），VEGF蛋白表达与对照组（3.06±0.15）相比分别降低至2.60±0.09、2.42±0.07、1.85±0.05、0.92±0.05、0.60±0.04，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论PAB可抑制人肝癌细胞BEL-7402中VEGF mRNA和蛋白的表达。

细胞系,肿瘤；肝肿瘤；血管内皮生长因子类；逆转录聚合酶链反应；印迹法,蛋白质；土槿乙酸

原发性肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤，全世界每年新发肝癌患者约60万，而我国每年新患病人数约占世界新发肝癌人数的55%，居恶性肿瘤发病率第二位[1]。手术切除术作为肝癌首选治疗方法，因其术后转移、复发等特点，病死率仍然很高[2]。研究表明，血管的生成是肿瘤生长、转移、侵袭的重要机制[3]。土槿乙酸（pseudolaric acid B,PAB）是土槿皮的主要活性成分之一，具有明确的抗生育、抗真菌、抗肿瘤及止血等作用。近年来，PAB的抗肿瘤作用越来越受到重视，其机制主要包括抑制细胞增殖、促进细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成等。血管内皮生长因子（VEGF）是最有效和特异的诱导肿瘤血管内皮生成的因子，是多种抗肿瘤药物的作用靶点。本研究探讨PAB对肝癌细胞BEL-7402中VEGF mRNA及蛋白表达的影响，为进一步开发治疗肝癌的新药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞BEL-7402购自江阴康众康民生物医药技术有限公司。PAB购自上海彩佑实业有限公司，溶于少量二甲基亚砜（DMSO）中，加双蒸水配制成400 μmol/L的水溶液，用培养液稀释成所需浓度，DMSO终浓度小于0.1%。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自碧波公司，引物购自大连宝生物工程有限公司。兔抗人单克隆抗体、一抗VEGF及GAPDH单抗购自Enogene公司。CO2细胞培养箱（HERA Cell Heraeus），显微镜购自日本奥林巴斯，细胞图像分析系统购自北京大恒图像分析有限公司，DYC-31D电泳槽购自北京市六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理 人肝癌细胞BEL-7402中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，内含100 U/L青、链霉素，在37℃、5%CO2、正常氧浓度饱和湿度的培养箱中培养，常规胰蛋白酶消化法传代细胞，传到第3代，取对数生长期细胞用于实验。细胞进入对数生长期后，将细胞按2×105/mL密度接种于6孔板，24 h细胞贴壁后，分别加入不同浓度的PAB，使其终浓度分别为0（对照组）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L，置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养6 h，收集细胞。

1.2.2 细胞活力测定 将不同浓度的PAB作用于人肝癌细胞BEL-7402，用0.4%台盼蓝染色5 min，在显微镜下观察死细胞染成蓝色，计数染色细胞和总细胞数目，细胞活率为未染色细胞占总细胞的百分率。

1.2.3 WST-8法检测细胞增殖 将人肝癌细胞BEL-7402按1×104/mL密度，每孔100 μL接种于96孔板，37℃、5%CO2孵育24 h，然后加入不同浓度PAB，培养箱中培养6 h后，每孔加入10 μL WST-8溶液，将培养板在培养箱中孵育2 h，酶标仪于450 nm波长下检测各孔的光密度（OD）值。

1.2.4 RT-PCR法检测VEGF mRNA表达水平 应用Primer Premier Version 5.0软件设计引物。VEGF引物上游5′-GGGCTGCTGCAATGACGA-3′，下游5′-GTTTAACTCAAGC TGCCTCGC-3′，扩增长度360 bp；β-actin引物上游5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3′，下游5′-GCATAGCACAGCCTGGATAG-3′，扩增长度250 bp。加入Trizol提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，OD260/OD280=1.6～1.8。取5 μg总RNA逆转录合成cDNA。2 μL cDNA用于PCR扩增。PCR反应：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，退火（VEGF 55℃，β-actin 52℃）30 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃最终延伸10 min，继之1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，应用Fluorchem 2.01软件进行分析，PCR产物VEGF条带与内参条带的OD值比值作为VEGF基因的相对表达量。实验重复3次。

1.2.5 免疫印迹（Western Blot）法检测VEGF蛋白表达水平 每孔细胞加入200 μL细胞裂解液提取蛋白，考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度为一致。制备10%SDS-page凝胶，每孔加入蛋白样品20 μg电泳分离蛋白，转印至PVDF膜后，5%脱脂奶粉TBS缓冲液封闭，加入兔抗人单克隆抗体，4℃过夜，洗膜30 min，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育，在新鲜配制的NBT/BCIP底物溶液中显色20 min，流水冲洗终止显色，照相。内参采用GAPDH。采用Fluorchem 2.01软件分析蛋白条带积分OD值（IDV）。以目的条带与内参条带的比值代表目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.3 统计学方法 用SPSS 17.0进行统计学处理，数据用均数±标准差（±s）表示，多组计量资料比较采用方差分析，组间多重比较采用Dunnett-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活力测定 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L PAB处理人肝癌细胞BEL-7402细胞活率均在95%以上。

2.2 细胞增殖分析 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L PAB处理人肝癌细胞BEL-7402细胞增殖率分别为（97.25±0.41）%、（97.11±0.41）%、（96.89±0.49）%、（96.87±0.49）%、（96.79±0.69）%、（96.66±0.57）%，差异无统计学意义（F=1.078，P＞0.05）。

2.3 PAB对人肝癌细胞BEL-7402中VEGF mRNA表达的影响 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L PAB处理人肝癌细胞BEL-7402 6 h后，VEGF mRNA表达水平分别为2.53±0.07、1.90±0.02、1.31±0.03、0.86± 0.04、0.60±0.03、0.34±0.02，差异有统计学意义（F= 1 330.22，P＜0.01），各浓度组均低于对照组（均P＜0.01），呈剂量依赖性，见图1。

Figure 1 Effects of PAB on the expression of VEGF mRNA in human hepatocellular carcinoma cells detected by RT-PCR图1 RT-PCR检测PAB对人肝癌细胞中VEGF mRNA表达的影响

2.4 PAB对人肝癌细胞BEL-7402 VEGF蛋白表达的影响 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/LPAB处理人肝癌细胞BEL-7402 6 h后，VEGF蛋白表达水平分别为3.06±0.15、2.60±0.09、2.42±0.07、1.85±0.05、0.92±0.05、0.60±0.04，差异有统计学意义（F=403.17，P＜0.01），各浓度组均低于对照组（均P＜0.01），呈剂量依赖性，见图2。

Figure 2 Effects of PAB on the expression of VEGF protein in human hepatocellular carcinoma cells detected by Western Blot assay图2 Western Blot检测PAB对人肝癌细胞VEGF蛋白表达的影响

3 讨论

VEGF是目前公认的最强的直接作用于血管内皮细胞的生长因子，是促进血管新生的主要因子之一[4]。成年人的肝脏血管非常丰富，由连续的内皮细胞围绕而成的毛细血管结构所形成的血管生成作用在肝癌中最为典型[5]。新生血管虽然能够为人体提供营养，排出肿瘤生长的代谢产物，但是，新生血管也是癌细胞扩散的重要途径，同样也是肿瘤生长、侵袭、转移的一个重要步骤[6]。

有研究证实，VEGF表达于肝癌细胞和正常肝细胞中，随着肝癌组织中血管生成作用的增强，VEGF的表达程度也逐渐增加，其表达水平大约是正常组织的7倍左右[7-8]。相关研究表明，肝癌组织中VEGF的表达与肝外转移、组织分型、临床分期、有无淋巴结等因素有关，在肝癌的发生发展及血管生成的过程中发挥着重要作用[9]。由此可见，通过抑制VEGF在肝癌中的表达来抑制肿瘤生长、血管新生及癌细胞转移十分重要。

土槿皮也叫土荆皮，是松科植物金钱松的干燥根皮或近根树皮。PAB是从土槿皮中分离出的20余种土槿酸之一，具有较强的细胞毒性作用[10]，传统上主要用于抗真菌感染，后来发现其具有抗生育、抗肿瘤及抗血管生成作用。有研究发现，PAB可以减少大鼠动脉外源性血管芽并打破微血管的新形成[11]。因此，PAB具有抑制体内血管增殖的能力。在无细胞毒性作用时，PAB还可以促进VEGF刺激后的人脐静脉内皮细胞凋亡，其作用机制是通过抑制VEGF诱导酪氨酸激酶受体即KDR/FLK 1磷酸化，从而阻断PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路，最终拮抗VEGF介导的抗凋亡效应[12]。

本研究结果显示，不同剂量的PAB对肝癌细胞中VEGF mRNA及蛋白表达与对照组相比降低，并呈量效关系，目前，抑制血管内皮细胞的生长，成为治疗肿瘤的重要途径。VEGF能结合特定的受体，使内皮细胞增生，增加血管通透性，促进了血浆外渗的纤维蛋白，最终形成新的血管腔[13]。本研究结果表明，PAB可以通过抑制人肝癌细胞中VEGF的表达来抵抗肝癌血管的形成，通过阻断肿瘤细胞的营养供给来抑制肝癌细胞的生长和转移，具有明确的抑制血管生成作用。

综上，PAB有明确的抗肿瘤、抗血管生成作用。作为中药，具有来源广泛、不良反应小、靶向作用强等优点，对其药理机制的深入研究有助于研发高效能的新型抗肿瘤药物。

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（2013-07-13收稿 2013-09-10修回）

（本文编辑 李国琪）

The Effect of Pseudolaric Acid on the Expression of VEGF in Hepatocellular Carcinoma Cells

ZHU Ping,GUO Lianyi
Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Liaoning 121001,China

ObjectiveTo investigate the effect of pseudolaric acid B(PAB)on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in human hepatoma BEL-7402 cells.MethodsBEL-7402 cells were cultured with PAB(0,0.5,1.0, 2.0,4.0 and 8.0 μmol·L-1)for 6 h and stained with 0.4%trypan blue.The cell viability was observed and calculated under the microscope.The cell proliferation was detected by WST-8 analysis.The expression of VEGF mRNA in BEL-7402 cells was detected using RT-PCR method.The expression of VEGF protein in BEL-7402 cells was detected using Western blot assay.ResultsThere was no significant difference in the cell proliferation of BEL-7402 cells between different PAB treatment groups and control group.With the increased concentration of PAB,the expressions of VEGF mRNA were significantly decreased in different PAB treatment groups(1.90±0.02,1.31±0.03,0.86±0.04,0.60±0.03 and 0.34±0.02)compared with that of control group(2.53±0.07,P＜0.01).The expressions of VEGF protein were significantly decreased in different PAB treatment groups(2.60±0.09,2.42±0.07,1.85±0.05,0.92±0.05 and 0.60±0.04)compared with that of control group(3.06±0.15, P＜0.01).ConclusionPAB can inhibit the expressions of VEGF mRNA and protein in BEL-7402 cells.

cell line,tumor;liver neoplasms;vascular endothelial growth factors;reverse transcriptase polymerase chain reaction;blotting,western;pseudolaric acid B

R735.7

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.004

辽宁医学院附属第一医院消化内科（邮编121001）

△通讯作者 E-mail:angel_gly@163.com