谭祎媚 张 逊 徐美林 王 菁 徐医军

RhoB和E-cadherin在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

谭祎媚1张 逊2△徐美林3王 菁3徐医军2

目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）中RhoB和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达及其临床意义。方法采用免疫组化Super Pic TureTMPolymer二步法，检测116例NSCLC组织（NSCLC组）和同期116例正常余肺组织（正常组）中RhoB和E-cadherin的表达，并分析其表达与患者临床病理特征及预后的关系。结果NSCLC组RhoB、E-cadherin阳性表达率均低于正常组（57.76%vs 87.07%，54.31%vs 85.34%，均P＜0.01）。NSCLC组织中RhoB的表达强度在不同肿瘤病理类型、肿瘤分化程度及淋巴结转移情况间的差异有统计学意义，E-cadherin的表达强度在不同TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移情况间的差异有统计学意义。NSCLC组RhoB与E-cadherin的表达呈正相关（r= 0.503，P＜0.01）。RhoB高表达的患者3年生存率高于低表达者（83.93%vs 40.00%，Log-rank χ2=18.992，P＜0.01）；E-cadherin高表达的患者3年生存率高于低表达者（85.11%vs 44.93%，Log-rank χ2=16.680，P＜0.01）。RhoB和E-cadherin共同低表达、淋巴结转移是影响NSCLC患者预后的危险因素。结论RhoB与E-cadherin在NSCLC组织中的表达呈现较好的相关性，检测二者的表达对判断NSCLC患者的临床病理学特征及预后有一定提示作用。

癌,非小细胞肺；钙黏着糖蛋白类；免疫组织化学；预后；Kaplan-Meiers评估；RhoB；E-钙黏蛋白

肺癌中85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），大量研究证明，NSCLC的侵袭与转移是造成其不良预后的主要原因[1]。Rho亚家族成员RhoB在肿瘤发生过程中是一个负调节因子，具有抑制某些肿瘤细胞增殖、上调细胞凋亡以及抑制炎症反应的作用[2]。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是分布在所有上皮组织中的跨膜糖蛋白，它具有促进上皮细胞间相互黏附、保持组织结构完整性的作用[3]。肺癌组织中RhoB、E-cadherin的表达及其与患者临床病理特征的关系已有相关研究，但其与患者预后关系的临床报道不多。本研究采用免疫组化法检测NSCLC组织及正常肺组织中RhoB、E-cadherin蛋白的表达，探讨其与NSCLC患者临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象及标本来源 选取天津市胸科医院2008年1月—12月NSCLC患者116例（NSCLC组），其中男85例，女31例。年龄32～78岁，平均（60.38±9.84）岁；所有病例均经病理证实，术前未经过放化治疗。按照UICC（Union for International Cancer Control）2009年修订的pTNM分期标准：Ⅰ期47例，Ⅱ期30例，Ⅲ期39例。按照WHO肺癌分类标准：鳞癌62例，腺癌39例，腺鳞癌15例。高、中分化86例，低分化30例。有淋巴结转移59例，无淋巴结转移57例。另收集同一患者的距癌组织＞5 cm、经HE染色证实无癌细胞浸润的正常余肺组织116例（正常组）。随访日期从2008年2月1日—2013年1月31日，生存期的计算从手术日期到随访截止日期，或由于复发、转移而死亡的日期为止。所有标本的使用均经天津市胸科医院伦理委员会同意，取得患者或家属的知情。

1.2 材料和试剂 兔抗人RhoB抗体、兔抗人E-cadherin抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物及二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法 手术切除后标本迅速经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋后连续切片，厚度5 μm，采用常规免疫组化Super Pic TureTMPolymer二步法检测，严格按照说明书进行操作，抗原修复采用高压高温热修复。采用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 阳性结果判断 RhoB蛋白主要表达于细胞的膜结构上；E-cadherin阳性表达主要位于细胞膜，部分位于细胞质。根据染色细胞百分率和染色程度进行评定和分析：每例均随机观察10个高倍视野（×400），每个视野计数100个细胞，阳性细胞率=阳性细胞数/观察细胞数×100%。阳性细胞率计分标准：≤10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度：黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将阳性细胞率得分和染色强度得分相乘即为最后得分：0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。在分析时将（-）和（+）定为低表达，（++）和（+++）定为高表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据处理，计数资料组间比较采用χ2检验，相关性分析用Spearman等级相关，对生存数据采用Kaplan-Meier分析并绘制生存曲线，应用Log-rank检验差异性，采用COX风险模型进行预后因素分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组RhoB和E-cadherin的阳性表达情况比较 NSCLC组RhoB、E-cadherin阳性表达率均低于正常组（均P＜0.01），见表1。2组RhoB主要表达于膜结构上（细胞膜或核膜），E-cadherin表达于细胞膜，正常组RhoB和E-cadherin的阳性表达均为高表达，见图1～6。

Table 1 Comparison of positive expressions of RhoB and E-cadherin between two groups表1 2组RhoB、E-cadherin的阳性表达情况 例（%）

2.2 NSCLC组RhoB、E-cadherin表达与患者临床病理特征的关系 RhoB、E-cadherin的表达强度在不同性别、年龄、吸烟与否、肿瘤部位、肿瘤最大直径间差异均无统计学意义。不同肿瘤病理类型、肿瘤分化程度及淋巴结转移情况下，RhoB在NSCLC组织中的表达强度差异有统计学意义；不同肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移情况下，E-cadherin在NSCLC组织中的表达强度差异有统计学意义，见表2。

2.3 NSCLC组RhoB与E-cadherin表达的相关性分析 NSCLC组RhoB与E-cadherin的表达呈正相关（r=0.503，P＜0.01），见表3。

2.4 RhoB、E-cadherin的表达与NSCLC患者预后的关系 116例NSCLC患者随访1～60个月，中位数44个月，失访3例。RhoB高表达和低表达患者3年生存率分别为83.93%（47/56）和40.00%（24/60），差异有统计学意义（Log-rank χ2=18.992，P＜0.01），见图7。E-cadherin高表达和低表达患者3年生存率分别为85.11%（40/47）和44.93%（31/69），差异有统计学意义（Log-rank χ2=16.680，P＜0.01），见图8。RhoB与E-cadherin共同高表达及共同低表达者的3年生存率分别为89.19%（33/37）、34%（17/50），差异有统计学意义（Log-rank χ2=24.385，P＜0.01），见图9。

2.5 多因素COX回归模型分析 以性别（男=1，女= 2）、年龄、病理类型、肿瘤分化程度、肿瘤最大直径、是否有淋巴结转移（是=1，否=2）及RhoB、E-cadherin是否共同低表达（是=1，否=2）为自变量，以生存时间为因变量，应用COX比例风险回归模型进行分析。结果显示RhoB和E-cadherin共同低表达、淋巴结转移是影响NSCLC患者预后的危险因素，见表4。

Table 2 Comparison of expression intensities of RhoB and E-cadherin between different clinical pathological characteristic groups of NSCLC表2 RhoB、E-cadherin的表达与NSCLC患者临床病理特征的关系 例（%）

Table 3 The correlation of expressions of RhoB and E-cadherin in NSCLC group表3NSCLC组RhoB与E-cadherin表达的相关性分析

Figure 7 The correlation between the expression of RhoB and the survival time of patients with NSCLC图7 RhoB的表达与NSCLC患者生存时间的关系

Figure 8 The correlation between the expression of E-cadherin and the survival time of patients with NSCLC图8 E-cadherin的表达与NSCLC患者生存时间的关系

Figure 9 The correlation between the high expression of both RhoB and E-cadherin,the low expression of both RhoB and E-cadherin and the survival time of patients with NSCLC图9 RhoB和E-cadherin共同高表达及共同低表达与NSCLC患者生存时间的关系

Table 4 Results of COX proportional hazards model for various prognostic factors in patients with NSCLC表4 COX比例风险回归模型分析结果

3 讨论

RhoB是Rho家族中一个较为独特的分子，在肿瘤恶性发展过程中，RhoB的表达通常是减弱的，体外实验也发现RhoB可抑制肿瘤细胞增殖、存活、侵袭和转移[4]。Bousquet等[5]通过RNA干扰敲除支气管非肿瘤细胞中的RhoB基因，发现RhoB表达降低可促进细胞迁移和侵袭。Mazieres等[6]研究发现，随着肺癌浸润性增高，RhoB在癌组织中的表达量大幅度下降，同时RhoB表达丢失与肺癌的高分期、高浸润性、低分化、高增殖指数等存在显著相关性，而RhoB过表达的A549细胞的增殖、生长等均显著下降。Sato等[7]研究显示112例原发NSCLC中有64例RhoB为不表达或低表达，与本研究结果一致。本研究中RhoB在正常余肺组织中呈高表达，在NSCLC组织中表达显著降低，且其在不同肿瘤病理类型、肿瘤分化程度及淋巴结转移情况间表达强度不同。

E-cadherin阳性表达有抑制肿瘤转移的功能，E-cadherin表达下降或缺失，细胞黏附力下降，造成细胞容易分散而向外周浸润性生长，一旦获得转移的必要条件，就可脱离原发灶而发生侵袭和转移[3]。近年来通过在肺癌、乳腺癌、甲状腺乳头状癌、膀胱癌、前列腺癌、大肠癌及鼻咽癌等肿瘤的研究中证实，E-cadherin表达降低与肿瘤的分化、侵袭和转移有显著相关性[8]。本研究中E-cadherin同样在大部分NSCLC组织中表达显著降低，其表达强度在不同TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移间有差异。

本研究结果显示，RhoB和E-cadherin共同高表达或共同低表达更容易出现在腺鳞癌、低分化、高分期及有淋巴结转移的患者中，且RhoB和E-cadherin共同低表达是致使NSCLC患者预后较差的危险因素。NSCLC组织中RhoB与E-cadherin的表达具有较好的相关性和一致性，提示RhoB和E-cadherin在促进肿瘤的发生、浸润的信号传导通路中发挥着相似的作用。RhoB在肺癌中的低表达或不表达可能主要是由组蛋白低乙酰化所引起，在应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理后的肺癌细胞系中可见显著的RhoB低表达[9]。而RhoB低表达可促进支气管上皮细胞的迁移和浸润，其主要是通过激活丝/苏氨酸蛋白激酶（Akt）并依赖于Rac1的激活，从而导致磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信号通路被激活［5]。Kazerounian等[10]发现RhoB缺失可促进肿瘤的生成及肿瘤细胞的生长，促进Akt信号传导通路在乳腺癌肿瘤细胞的发生。Howe等[11]提出RhoB在内皮细胞的迁移、出芽和毛细血管形成中发挥重要作用，其部分机制为抑制RhoA/ROCK信号通路。由此可见，RhoB表达丢失可能是肺癌细胞获得浸润性的特征之一，其作用机制可能和PI3K/Akt信号通路被激活有关。研究还发现，E-cadherin通过介导表皮生长因子受体对PI3K/Akt的激活而对肿瘤细胞增殖产生作用[12]。E-cadherin可抑制NSCLC细胞的增殖和浸润，可能通过下调RhoA或Cdc42的表达来实现，当敲除RhoA或Cdc42基因，使NSCLC细胞增殖和浸润能力均显著下降[13]。可见，RhoB和E-cadherin在肿瘤发生发展的信号传导通路中有一定的交叉点。

Figure 1 The expression of RhoB in squamous carcinoma图1 RhoB在鳞癌中的表达（SP，×400）

Figure 2 The expression of RhoB in adenocarcinoma图2 RhoB在腺癌中的表达（SP，×400）

Figure 3 The expression of E-cadherin in adenocarcinoma图3 E-cadherin在腺癌中的表达（SP，×400）

Figure 4 The expression of E-cadherin in squamous carcinoma图4 E-cadherin在鳞癌中的表达（SP，×400）

Figure 5 The expression of RhoB in the normal lung tissue图5 RhoB在正常余肺中的表达（SP，×400）

Figure 6 The expression of E-cadherin in the normal lung tissue图6 E-cadherin在正常余肺中的表达（SP，×400）

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（2013-06-01收稿 2013-08-01修回）

（本文编辑 陈丽洁）

The Expression and Clinical Significance of RhoB and E-Cadherin in Non-Small-Cell Lung Cancer Tissues

TAN Yimei1，ZHANG Xun2，XU Meilin3，WANG Jing3，XU Yijun2
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China；2 Department of Thoracic Surgery,3 Department of Pathology,Tianjin Chest Hospital

ObjectiveTo investigate the expressions of RhoB and E-cadherin in non-small-cell lung cancer (NSCLC),and their clinical significances thereof.MethodsImmunohistochemical staining was applied to detect expressions of RhoB and E-cadherin in 116 samples of NSCLC(NSCLC group)and 116 samples of normal lung tissues(control group).Correlations of expressions of RhoB and E-cadherin to clinical pathological parameters and prognosis were analyzed in two groups.ResultsThe expression intensities of RhoB and E-cadherin were significantly lower in NSCLC group than those in control group(57.76%vs 87.07%，54.31%vs 85.34%，P＜0.01).There were significant differences in the expression of RhoB between different pathological types,differentiation and lymph node metastasis in NSCLC group.There were significant differences in the expression of E-cadherin between different TNM stages,differentiation and lymph node metastasis in NSCLC group.The expression of RhoB was positively correlated with the expression of E-cadherin(r=0.503，P＜0.01).The 3-year survival rates were significantly higher in patients with high expression of RhoB(83.93%)than those in patients with low expression of RhoB(40.00%,Log-rank χ2=18.992，P＜0.01).The 3-year survival rates were significantly higher in patients with high expression of E-cadherin(85.11%)than those in patients with low expression of E-cadherin (44.93%,Log-rank χ2=16.680，P＜0.01).Further multivariate analysis suggested that both lower expressions of RhoB and E-cadherin and lymph node metastasis were prognostic indicators for NSCLC(P＜0.001).ConclusionThe expressions of RhoB and E-cadherin showed a good correlation in NSCLC.Detecting the expression of RhoB combined with E-cadherin may give a clue on clinicopathological features and prognosis in patients with NSCLC.

carcinoma，non-small-cell lung cancer;cadherins;immunohistochemistry;prognosis;Kaplan-Meiers estimate;RhoB;E-cadherin

R734.2

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.009

1天津医科大学（邮编300070）；2天津市胸科医院胸外科，3病理科

△通讯作者 E-mail：zhangxun69@163.com