马东东 曹 波 路婷婷 周玉杰 葛善珍 陈 虹 卢 涛

SchB对UVA损伤HaCat保护作用的研究*

马东东1曹 波2路婷婷2周玉杰1葛善珍1陈 虹2卢 涛3△

目的 探讨五味子乙素（SchB）对长波紫外线（UVA）诱导永生化人角质形成细胞（HaCat细胞）损伤后的保护作用及其可能的作用机制。方法用5 J/cm2的UVA照射HaCat细胞，给予不同浓度的SchB（0.1、0.01、0.001、0.000 1 μmol/L）处理UVA损伤后的HaCat细胞，检测细胞超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，乳酸脱氢酶（LDH）及NO含量。结果UVA照射HaCat细胞后，SOD、GSH-Px活性降低，LDH及NO含量升高，给予不同浓度的SchB均能显著提高SOD、GSH-Px活性，降低LDH及NO含量，提高HaCat细胞的存活率，尤其以0.001 μmol/L SchB的保护作用最强。结论0.001 μmol/L SchB减轻UVA对HaCat细胞损伤的效果最佳。

五味子素；紫外线；皮肤；细胞，培养的；HaCat细胞

随着大气臭氧层的破坏，紫外线对人体皮肤的损伤也越来越严重，主要包括长波紫外线（UVA，320～340 nm）和中波紫外线（UVB，290～320 nm）。UVA对皮肤的损伤程度高于UVB，其会导致皮肤真皮组织中的胶原及弹力纤维降解、皮肤光敏反应发生[1]、皮肤免疫功能降低[2]及皮肤肿瘤形成[3]。五味子乙素（SchB）可抑制大鼠肝脏质膜中丙二醛（MDA）的增加[4]，维持细胞在氧化损伤状态下的稳定性。在四氯化碳引起大鼠肝细胞脂质过氧化损伤的模型中，SchB可使肝细胞MDA、乳酸脱氢酶（LDH）及丙氨酸转氨酶（ALT）释放减少，肝细胞的存活率明显提高。SchB还可减轻过氧化氢（H2O2）对心肌细胞的氧化损伤，表现为MDA及LDH降低，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性增高[5]。但SchB在皮肤抗老化方面的研究较少。本研究旨在研究SchB是否对UVA照射后的永生化人角质形成细胞（HaCat细胞）有保护作用，并对其保护机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 NikonTS-100倒置显微镜；台式紫外线辐射仪（上海，Sigma公司）；SW-CJ-2FD型双人单面净化台，苏州净化设备有限公司；MCO-AC型CO2细胞培养箱，SANYO公司；多功能酶标仪，Thermo Scientific公司。DMEM液体培养基为天润善大公司产品；胎牛血清（FBS）购自中国医学科学院血研所科技公司；二甲基亚砜（DMSO）考马斯亮蓝G250为FLUKA公司产品；胰酶（Trypsin）、DMSO购于GIBECO公司。SchB相对分子质量400，由天津武警后勤医学院生药学教研室陈虹教授研究室提供，体外实验用DMSO配制。

1.2 实验分组及照射方法 将盛有传代HaCat细胞的培养瓶放入5%CO2孵箱中培养，10%FBS的低糖DMEM培养，每天换液。实验设对照组（不经UVA照射）、模型组（UVA照射剂量为1、5、10、15 J/cm2）及ShcB 1～4组（UVA照射后分别加入ShcB 0.1、0.01、0.001、0.000 1 μmol/L）。UVA波长为320～400 nm，照射距离为1 cm。倒去各组的细胞培养液，PBS洗2次，再加入适量的冷PBS覆盖，照射后加入无血清的培养液继续培养，通过检测细胞存活率来确定合适的照射强度。采用合适强度UVA处理HaCat细胞，给予不同浓度的SchB处理UVA损伤后的HaCat细胞。

1.3 噻唑蓝（MTT）实验 取对数生长期HaCat细胞，胰酶消化后制备细胞悬液，调整浓度为1.5×105个/mL，每孔100 μL的细胞悬液加入96孔板中，培养36 h后做UVA处理，每组设6个复孔。ShcB组UVA照射2 h后加入不同浓度SchB。所有研究组继续培养24 h后，每孔加入50 μL的MTT，37℃5% CO2孵箱培养4 h后，加DMSO 4 h，在震荡仪上震荡4 min后在酶标仪550 nm处测定光密度（OD）值，计算细胞存活率=1-（对照组OD值-模型组OD值）/对照组OD值。

1.4 氧化损伤实验 取对数生长期HaCat细胞，胰酶消化后制备细胞悬液，调整浓度为1×105个/mL，铺到10 cm的培养皿中培养，设对照组、模型组、ShcB 1～4组，放入5%CO2孵箱中，培养36 h后，用5 J/cm2的UVA照射2 h，ShcB 1～4组给药，继续培养24 h后，取上清液酶生化法测定细胞外的GSH-Px、双氧化物歧化酶（SOD）、LDH和NO的含量。

1.5 统计学方法 用SPSS 17.0进行统计学分析。实验数据均用±s表示，各组之间均数的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UVA实验照射剂量的确定 对照组和1、5、10、15 J/cm2模型组HaCat细胞的存活率分别为（100.00± 6.31）%、（98.10±5.78）%、（75.05±8.64）%、（66.10± 5.61）%和（53.71±2.59）%，差异有统计学意义（F= 18.805，P＜0.01）。随UVA照射剂量增大，HaCat细胞存活率逐渐降低，预实验发现细胞存活率低于70%时，再加用SchB时受损HaCat细胞几乎不再增殖，GSH-Px、SOD、LDH、NO几乎无差别，不符合实际情况，故选择5 J/cm2作为实验照射剂量。

2.2 不同浓度SchB对UVA损伤后HaCat细胞的保护作用 SchB 3组细胞存活率最高，但随SchB浓度降低，药物的保护作用减弱，见表1。

2.3 不同浓度SchB对HaCat细胞GSH-Px、SOD、LDH、NO含量的影响 与对照组比较，模型组的GSH-Px、SOD活性降低，LDH、NO含量升高（P＜0.05）。与模型组比较，SchB 1～4组均能提高SOD活性，降低LDH、NO含量，除SchB 4组外，SchB 1～3组均能提高GSH-Px活性，见表1。

3 讨论

UVA辐射可诱导细胞产生活性氧簇（ROS）。ROS攻击细胞膜上不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化反应，产生更多的ROS，导致皮肤细胞DNA的光损伤[6]，表现为皮肤的表皮和真皮层的损伤。

Table 1 Effects of different concentrations of SchB on cell survival rates and laboratory indexes of HaCat cells表1 不同浓度的SchB对HaCat细胞存活率及实验室指标的影响 （n=6±s）

Table 1 Effects of different concentrations of SchB on cell survival rates and laboratory indexes of HaCat cells表1 不同浓度的SchB对HaCat细胞存活率及实验室指标的影响 （n=6±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组SchB 1组SchB 2组SchB 3组SchB 4组F NO (μmol/L) 0.17±0.04 0.38±0.03a0.26±0.03b0.21±0.04b0.19±0.02b0.27±0.05b1 852.481＊＊细胞存活率（%）100.00±3.12 77.11±3.33a91.78±6.47b92.52±5.39b98.39±3.23b90.61±5.78b11.071＊＊GSH-Px（μmol/L）7.16±0.18 2.54±0.34a3.17±0.18b4.95±0.15b8.34±0.33b3.01±0.28 117.232＊＊SOD（U/mL）8.47±0.50 3.22±0.15a6.73±1.98b6.78±1.22b7.79±1.22b5.68±1.37b8.853＊＊LDH (U/mL) 3.34±0.03 7.80±1.06a5.79±0.68b4.49±0.01b4.00±0.98b6.02±0.26b59.406＊＊

SchB为五味子中的单体活性成分，其可以清除肝细胞中的自由基及脂质过氧化物，并可提高肝细胞中抗氧化物酶的表达。侯微等[7]研究发现，SchB可以减轻H2O2造成HaCat细胞的氧化应激损伤，从而起到一定的保护作用，与本实验的结果相似。本实验通过检测皮肤的保护性指标SOD、GSH-Px的含量和损伤性指标LDH、NO的含量发现，随着SchB浓度的降低，其对HaCat细胞保护作用越强，当浓度降到0.001 μmol/L时，保护作用最强。因此不是SchB浓度越高，保护作用就越强，0.001 μmol/L的SchB为最适浓度，过高及高低的浓度保护效果均不佳，原因有待相关试验进一步分析。

[1]Smith E,Kiss F,Porter RM，et al.A review of UVA-mediated photosensitivity disorders[J].Photochem Photobiol Sci,2012，11(1):199-206.

[2]梁俊琴，普雄明.紫外线与皮肤免疫[J].中国免疫学杂志，2009，25(9)：863-865．

[3]Halliday GM,Byrne SN,Damian DL.Ultraviolet A radiation：its role inimmunosuppression and carcinogenesis[J].Semin Cutan Med Surg,2011,30(4):214-221．

[4]Lu H,Liu GT.Anti-oxidant activity of dibenzocyclooctene lignans isolated from Schizandrae[J].Planta Med,1992,58(4):311-313.

[5]汪云开.五味子乙素对过氧化氢损伤心肌细胞的保护作用[J].中国中西医结合急救杂志,2012,19(1)：5-8.

[6]Fisher GJ,Kang S,Varani J,et al.Mechanisms of photo aging and chronological skin aging[J].Arch Dermatol,2002,138(11):1426-1470.

[7]侯微,魏忠宝,高薇,等.五味子甲素乙素及丙素对HaCat细胞氧化损伤的保护作用研究[J].安徽农业科学,2013,41(3)：1047-1049．

（2013-08-07收稿 2013-10-23修回）

（本文编辑 魏杰）

The Protective Effect of Schisandrin B on the Damage of Immortal Human Keratinocytes Induced by UVA

MA Dongdong1,CAO Bo2,LU Tingting2,ZHOU Yujie1,GE Shanzhen1,CHEN Hong2,LU Tao3
1 Hebei United University,Tangshan 063009,China;2 Tianjin Armed Police Logistics Department,School of medicine；3 Armed Police Hospital of Tianjin Institute of Dermatology Logistics

ObjectiveTo explore the protective effect of schisandrin B(SchB)on the permanent damage of human keratinocytes(HaCat)induced by long wave ultraviolet(UVA)，and its possible mechanism thereof.MethodsAfter HaCat was treated by 5 J/cm2UVA,different concentrations of SchB(0.1,0.01,0.001 and 0.000 1 μmol/L)were used to treat HaCat cells.The levels of superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px)activity,lactate dehydrogenase(LDH)and NO content were detected.ResultsThe levels of SOD and GSH-Px activity were decreased,and he levels of LDH and NO content were increased in HaCat cells after being treated by UVA.The different concentrations of SchB showed significant effects on the increased levels of SOD,GSH-Px activity and decreased levels of LDH and NO,and improved the survival rate of HaCat cells.The 0.001 μmol/L SchB showed the strongest protective effect.ConclusionThe 0.001 μmol/L SchB showed the best effect on the damage of HaCat cells induce the UVA.

SCHIZANDRIN;ultraviolet rays;skin;cells,cultured;HaCat cells

R758.1

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.002

*国家自然科学基金资助项目（项目编号：81072964）

1河北联合大学（邮编063009）；2天津武警后勤学院生药教研室；3天津武警后勤学院附属医院皮肤科

△通讯作者 E-mail:48144051@qq.com