刘炳祥，欧 强

(1上海市闸北区中心医院，上海200070;2上海市浦东医院)

结核性脑膜炎(简称结脑)病情凶险，病死率和致残率极高，其预后与早期诊断、及时治疗密切相关［1，2］。代谢组学是后基因组时代的一个重要研究领域，通过比较刺激前后或不同病理生理状态下的代谢图谱，能够揭示疾病发生发展的代谢机制，发现和筛选生物标志物，并为进一步探索治疗靶点提供有用信息［3～7］。2009年12月 ～2012年12月，我们采用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)观察了结脑患者脑脊液代谢组学的变化。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 诊断标准:①有典型的结脑临床表现和CSF改变，临床抗结核治疗有效;②CSF涂片抗酸杆菌阳性，或结核杆菌培养阳性，或结核杆菌DNA PCR扩增阳性。选择符合上述诊断标准的结脑患者15例(结脑组)，其中男11例、女4例，年龄(46.0±7.8)岁。另选择需腰麻的外伤手术患者14例(对照组)，排除中枢神经系统感染性疾病，其中男10例、女4例，年龄(44.1±8.5)岁。两组年龄、性别具有可比性(P均＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 采集两组的 CSF 1 mL，4℃下8 000 r/min离心10 min，－80℃保存备用。取CSF样品100μL，加入300μL冷HPLC级乙腈/甲醇的混合溶液(ACN∶MeOH=1∶1;v/v);涡旋混合2 min后，于4℃下静置10min，14 000 r/min离心15min;取上清液250μL于GC小瓶(离心管)中，减压挥干溶剂。

1.2.2 GC-MS分析 本实验的仪器分析平台为Agilent7890A GC/5975C MS系统。衍生化步骤:加入75∶1甲氧胺吡啶溶液(15 mg/L)，涡旋lmin后密闭，70℃下放置1 h;加入75μL三甲基硅烷化试剂(MSTFA∶TMCS=100∶1，v/v)，涡旋后密闭，室温下反应1 h。样品衍生化后再加入150μL正庚烷稀释，混匀后离心，取上清液进行GC-MS分析。GCMS分析测试参数设置:进样口温度270℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，质谱检测范围60～600 m/z，载气 He(0.8 mL/min)，进样量 0.2 μL，不分流进样。全扫描形式进行质谱检测，谱峰检测和重叠峰分辨分别使用MSDchem和NIST08软件，NIST质谱数据库提供化合物检索和指认。升温程序:初始温度70℃，保持5 min;以10℃/min的速度升至100℃，保持5 min;以10℃/min的速度升至200℃，保持5 min;以100℃/min的速度升至300℃，保持10 min。

图1 两组CSF经GC-MS分析后的TIC

1.2.3 模式分析 在R软件平台下采用自写的程序代码提取原始数据信号，导入TagFinder软件进行保留时间校正、峰对齐和碎片归属分析，所有参数均为缺省设置。在EXCEL软件中进行后期编辑，将结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观察量(样本)和积分面积。最后将数据导入到Simca-P11.0商业软件中进行非监督主成分分析(PCA)［8］和有监督的正交偏最小二乘方判别分析(O-PLS-DA)，模型验证参数为R2Y、Q2，R2Y代表模型可解释的变量，Q2代表模型的可预测度，R2Y、Q2高于0.5即认为该模型稳定可靠。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件。数据采用±s表示，选择较优的模式分析两组主成分的重要性因子(VIP)值，进行t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组GC-MS分析结果 两组CSF经GC-MS分析后，得到代表性总离子流图(TIC)，见图1。

2.2 PCA和O-PLS-DA分析结果 采用PCA分析共得到6 个主成分，R2Y=0.783，Q2=0.675;采用 OPLS-DA分析共得到1个主成分和1个正交成分，R2Y=0.935，Q2=0.887;O-PLS-DA 方法的 R2Y 和 Q2参数值均高于PCA，提示O-PLS-DA要优于PCA。

2.3 两组CSF差异代谢物分析结果 根据保留时间和片段鉴定代谢产物，搜索NIST商业数据库定性差异性代谢物。根据GC-MS的TIC中各峰保留时间选择共有峰，用相对峰面积(各峰与内标峰的比值)来表示代谢物水平，以判断变化趋势。与对照组比较，结脑组CSF中的代谢物表达下调10个(L-苏氨酸、来苏糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、十二烷酸、十六烷酸、十八烷酸、单棕榈酸甘油、十八酸甘油酯)，表达上调1个(山梨醇)，见表1。

表1 两组CSF差异代谢物分析结果

3 讨论

代谢物居于基因和蛋白质的下游，其水平变化可以说明生物体对外源刺激和病理变化的综合应答［9］。通过模式识别方法分析机体在不同状态下的代谢表型和代谢动态变化，可以更好地了解病变过程及机体内物质的代谢途径和作用机制［10］。GCMS是当前最为活跃的联用技术，具有很好的分离效率，可由计算机对MS图谱进行化合物数据库的自动检索核对，有利于迅速鉴识样品［11，12］。我们运用GC-MS技术，对结脑和正常对照者CSF样本进行检测，通过对检测到的代谢物离子及其相对含量进行多元统计学分析，建立了基于模式识别技术的代谢轮廓聚类区分模型。

本试验发现，结脑患者CSF中来苏糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖水平均有不同程度下降，提示结脑患者糖代谢发生严重紊乱。推测可能为结核杆菌破坏了脑膜细胞，损伤的脑膜细胞释放出葡萄糖酵解酶，促进了糖酵解过程，使得CSF中糖含量降低。同时一些炎症细胞的代谢产物抑制了血脑屏障的膜携带运转功能，使血糖向脑脊液运转发生障碍，导致脑脊液糖含量减少。临床上关注并监测CSF中这类物质，可能有利于辅助诊断和评估病情。

L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，参与构成机体免疫系统，是动物免疫球蛋白分子中的主要氨基酸之一。缺乏苏氨酸会抑制免疫球蛋白和T细胞、B细胞及其抗体的产生。在炎症性疾病发生时，机体对苏氨酸的需求增加，用于合成急性反应蛋白。结脑患者CSF中L-苏氨酸显著降低，提示结脑患者氨基酸代谢紊乱。推测可能是机体炎症反应加剧，苏氨酸大量参与抗氧化作用，导致消耗增加。故密切关注苏氨酸的动态变化，对于了解病情具有非常重要的作用。有研究发现，补充苏氨酸能够满足由感染所致氨基酸需求的增加，减少肌肉蛋白的降解［13］。临床上对苏氨酸水平显著下降的结脑患者应积极给予补充，加强营养支持治疗。

累积的山梨醇直接产生神经毒性作用，影响蛋白激酶活性，使 Na+-K+-ATP酶转运Na+和K+的能力减弱，细胞膜去极化受阻，细胞内渗透压增高，细胞肿胀、变性、坏死，从而导致神经细胞膜结构和功能的完整性受损，出现神经病变［14］。结脑患者CSF中山梨醇水平升高，可能与多元醇代谢通路异常活跃有关。本研究还发现，结脑患者CSF中十二烷酸、十六烷酸、十八烷酸、单棕榈酸甘油及十八酸甘油酯水平较正常人显著降低，提示结脑患者脂肪酸代谢出现紊乱，其确切机制尚待进一步研究。

总之，本研究采用GC-MS对结脑患者CSF代谢轮廓进行了研究，发现了一些与结脑相关的特征代谢物，可以从分子水平更好地认识结脑的发生机制，为其诊断和治疗靶点提供可靠的分子水平上的代谢证据。

［1］Sheu JJ，Yuan RY，Yang CC.Predeictors for outcome and treatment delay in patients with tubrculous meningitis［J］.Am JMed Sci，2009，338(2):134-139.

［2］Chugh A，Husain M，Gupta RK，et al.Surgical outcome of tuberculousmeningitis hydrocephalus treated by endoscopic third ventriculostomy:prognostic factors and postoperative neuroimaging for functional assessment of ventriculostomy［J］.J Neurosurg Pediatr，2009，3(5):371-377.

［3］马素娜，许前磊，谢世平，等.基于液质联用技术的HIV/AIDS患者尿液代谢组学研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(21):153-156.

［4］Spratlin JL，Serkova NJ，Eckhardt SG.Clinical applications of metabolomics in oncology:a review［J］.Clin Cancer Res，2009，15(2):431-440.

［5］Yin P，Wan D，Zhao C，et al.Ametabonomic study of hepatitis B-induced liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma by using RP-LC and HILIC coupled withmass spectrometry［J］.Mol Biosyst，2009，5(8):868-876.

［6］Schicho R，Nazyrova A，Shaykhutdinov R，et al.Quantitative metabolomic profiling of serum and urine in DSS-induced ulcerative colitis ofmice by(1)H NMR spectroscopy［J］.J Proteome Res，2010，9(12):6265-6273.

［7］齐素文，戴勇，欧阳昕，等.轻微肝性脑病患者血清中代谢物组的研究［J］.第三军医大学学报，2011，33(23):2503-2507.

［8］许广艳，葛卫红.代谢组学的数据分析技术及其应用［J］.时珍国医国药，2011，22(7):1755-1758.

［9］李育，赵靖霞，杨根金，等.早期肾透明细胞癌患者血清的核磁共振氢谱代谢组研究［J］.第二军医大学学报，2012，33(1):67-70.

［10］夏建飞，梁琼麟，胡坪，等.代谢组学研究策略与方法的新进展［J］.分析化学，2009，37(1):136-143.

［11］刘树业，段樱，李娴.代谢组学的进展及肝脏代谢组学［J］.分子诊断与治疗杂，2009，1(3):197-201.

［12］王静，袁子民，孔宏伟，等.基于气相色谱—质谱联用的代谢组学用于黄连治疗Ⅱ型糖尿病的机理探索［J］.色谱，2012，30(1):8-13.

［13］Faure M，Chone F，Mettraux C，etal.Threonine utilization for synthesisof acutephase proteins，intestinal proteins，and mucim is increased during sepsisin rats［J］.JNutr，2007，137(7):1802-1807.

［14］杨美玲，穆景阳，卢华爱，等.复方丹参片对糖尿病大鼠山梨醇代谢通路的影响［J］.宁夏医学杂志，2010，32(12):1099-1101.