李子青 薛芬 陈冠婕 王化宁 彭正午 谭庆荣

不同刺激参数rTMS对慢性不可预见应激大鼠行为的作用及大脑BDNF水平的影响*

李子青 薛芬 陈冠婕 王化宁 彭正午 谭庆荣

目的观察不同刺激参数重复经颅磁刺激(rTMS)对慢性不可预见应激(CUS)模型大鼠行为学的作用，并观察其对大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)水平的影响。方法64只SD大鼠随机分为对照组(8只)、模型组(8只)和干预组(共6个亚组，每组8只)。对照组正常饲养21d后连续7d给予rTMS假刺激;模型组在造模后连续7d给予rTMS假刺激;干预组在造模后每天给予不同频率和强度的rTMS刺激，连续7 d。实验期间观察大鼠体质量的变化，并采用运动箱和强迫游泳实验评估大鼠抑郁样行为，最后以酶联免疫吸附法测定大脑BDNF的水平。结果(1)造模结束后，对照组大鼠的体质量、强迫游泳静止时间与其他两组相比均存在显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)，而模型组和干预组大鼠比较没有上述差异(P＞0.05)。各组大鼠水平运动距离没有显著性差异(P＞0.05)。(2)rTMS干预后，①模型组大鼠的体质量显著低于对照组及干预组(5 Hz，0.84/1.26 T和10 Hz，0.84/1.26 T)(P＜0.05)。②各组大鼠水平运动距离之间没有显著性差异;模型组强迫游泳静止时间百分比明显高于对照组及干预组(P＜0.05)。③模型组BDNF的水平低于对照组，而一定刺激条件的rTMS可以改善这一现象。④双因素方差分析显示，刺激频率可能是改善大鼠抑郁行为和调节BDNF的关键因素，而且5 Hz的抗抑郁效应更为显著。结论不同刺激参数的rTMS对CUS动物抑郁行为的改善作用存在差异，大脑BDNF水平的变化可能参与了这一改善过程。

重复经颅磁刺激慢性不可预见应激脑源性神经营养因子大鼠

抑郁症是目前临床上最常见的精神疾患之一，是以情绪低落、思维迟缓并伴有兴趣减低、主动性下降等精神运动性迟滞症状为主要临床表现的一类心境障碍综合征。其发病率呈逐年上升的趋势，严重影响着人类的健康和生活质量，也给社会带来了沉重的经济负担［1］。抑郁症的发病原因涉及生物、心理、社会等多方面因素，并且与遗传因素有着密切关系，但其病因及发病机制尚不完全明了［2］。目前，抗抑郁药物是治疗抑郁症的首选方式，它们可以有效缓解抑郁症状，并且能够抑制其复发［3，4］，但是，抗抑郁药物的抗抑郁疗效并不令人满意，而且大多数抗抑郁药物往往具有不同的副作用［5，6］。因此，开发新的抗抑郁疗法具有重要意义。重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)做为新的治疗手段，目前已被越来越多的应用于临床，而且在2008年被美国FDA批准用于抑郁症的临床治疗。但是，rTMS作用参数的选择仍然存在争议，不同强度和频率的rTMS作用的分子生物学机制亦不明确。

因此本实验通过建立CUS抑郁动物模型，观察了不同频率(1 Hz、5 Hz和10 Hz)和强度(0.84 T和1.26 T)rTMS对其体质量、抑郁行为以及大脑BDNF表达的作用，为rTMS治疗参数的选择提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物64只成年雄性清洁级Sprague Dawley (SD)大鼠，体质量150～180 g，由第四军医大学实验动物中心提供。所有大鼠适应性饲养7 d后，按照数字随机法分为对照组(8只)、模型组(8只)、干预组(按照刺激参数的不同，分为1 Hz、0.84 T，1 Hz、1.26 T，5 Hz、0.84 T，5 Hz、1.26 T，10 Hz、0.84 T，10 Hz、1.26 T共6个处理组，每组8只)。

1.1.2 主要试剂和仪器BDNF大鼠Elisa试剂盒(SunRed，0477)，YRD CCY－Ⅰ磁场刺激仪和小动物刺激线圈拍(武汉依瑞德公司)，磁场强度测试仪(Bell公司)，大鼠强迫游泳测试记录箱(上海吉量公司)，酶联免疫检测仪(BioTek公司)，TopScan行为学分析系统(Clever Sys公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验过程对照组正常饲养21 d后连续7 d给予rTMS假刺激;模型组为CUS造模结束后，连续7d给予rTMS假刺激;干预组在CUS造模结束后，每天给予不同频率和强度的rTMS刺激，连续7 d。每周末记录大鼠体质量，最后一次rTMS干预结束24 h后，检测大鼠的行为学表现，随后提取脑组织蛋白，采用ELISA方法检测BDNF表达水平。

1.2.2CUS模型的建立模型组和干预组接受CUS处理，CUS模型的建立包括以下处理:(1)昼夜节律颠倒和光照性质改变(闪光刺激、昼夜颠倒、间断光照); (2)食物和饮水供应的改变(禁食、禁水);(3)居住环境的改变(单笼饲养、鼠笼倾斜、潮湿垫料);(4)短时间内足底电击;(5)强迫游泳;(6)束缚应激;(7)高温环境;(8)噪音干扰;(9)陌生气味;(10)陌生异常物品(塑料杯、木勺、碎布片等)。几种不同的应激处理在实验中全部应用，顺序随机，使动物不能预料刺激的发生。整个造模过程持续3周。

1.2.3rTMS刺激模式线圈拍的中点放在大鼠头颅顶点;刺激频率和强度如前所述，通过调整刺激串之间的间隔，使得不同频率rTMS作用的时间相一致;每天1 000个脉冲，连续7 d(共7 000个脉冲)。rTMS假性刺激是将rTMS的拍子置于大鼠头上5 cm处并且旋转90度，确保大鼠能感受到线圈拍的震动但处于rTMS磁场之外。由于rTMS干预的整个过程中大鼠会受到人为的束缚，为了排除非特异性应激对大鼠造成的影响，rTMS干预前1周，将大鼠置于相似的环境中，即每只大鼠每天接受相同的束缚及rTMS噪声刺激15 min。

1.2.4 强迫游泳实验将大鼠放入圆柱形玻璃瓶中(高45 cm，直径55 cm，水深25 cm，水温22～24℃)，每桶一只大鼠。实验第一天，每只大鼠预游泳15 min，随后取出擦干放入笼中。24 h之后再次将大鼠放入水中即开始计时，连续观察5 min，记录每只大鼠在水中“不动时间”的百分率。其中，“不动”定义为大鼠三肢不动，第四肢只有轻微的运动。

1.2.5 运动箱实验将大鼠单独置于运动行为观察箱中(底面积47 cm×47 cm，高47 cm的隔音箱)，10 s适应期后，使用红外线摄像头记录大鼠运动行为10 min，采用Topscan视频分析系统分析大鼠的水平运动总路程。

1.2.6BDNF酶联免疫吸附法(ELISA)检测每组脑组织按重量加入适量PBS，冰上匀浆，4℃，12 000 rpm离心10 min;并使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量;按照BDNF试剂盒说明书向96孔板加入标准液体和待测样品，并向每个样品孔加入BDNF抗体10 μl及Str－HRP 50 μl;轻轻震荡，37℃孵育1 h;洗涤液洗板6次，每孔加入50 μl A液和50 μl B液，置37℃暗处反应10min;每孔加入50 μl终止液，在450 nm测吸光度(OD)值，绘制标准曲线并计算BDNF的含量。

1.3 统计分析采用SPSS14.0统计软件进行数据分析。所有统计数据均采用均数±标准差(x±s)表示。组间差异采用单因素方差分析或双因素方差分析，两两数据比较则采用LSD检验，设P＜0.05时有统计学意义。

2 结果

2.1 各处理组体质量变化对各处理组进行方差分析发现，各处理组基线时及入组后第1、2周末体质量比较无显著性差异(F=0．521，P=0．814;F=0．803，P =0．589;F=1．028，P=0．424)，入组后第3、4周末体质量比较存在显著性差异(F=2．469，P=0．030;F= 3．106，P=0．009)。进一步两两比较t检验显示，入组3周末，对照组与其他组大鼠体质量之间存在显著性差异(P＜0.01);入组4周末，对照组体质量与模型组，1 Hz、0.84 T干预组和1 Hz、1.26 T干预组之间存在显著性差异(P＜0．05，P＜0.01)，而5 Hz、0.84 T干预组，5 Hz、1.26 T干预组，10 Hz、0.84 T干预组，10 Hz、1.26 T干预组与对照组体质量比较没有显著性差异(P＞0．05)，但是与模型组比较，存在显著性差异(P＜0．05)。见表1。入组后第4周末各干预组的体质量经双因素方差分析，结果显示，刺激强度(F= 2．244，P=0．119)和频率(F=0．06，P=0．807)的不同水平对体质量的影响不显著，而且这两个因素之间也没有交互作用(F=0．014，P=0.986)。

表1 各组大鼠体质量的变化(x±s)

2.2 各组大鼠行为学实验结果比较运动箱实验结果显示，各处理组大鼠rTMS干预前后的水平运动距离之间没有显著性差异(P＞0.05)。强迫游泳实验结果显示:造模结束后，对照组与模型组和干预组之间不动时间百分比均存在显著性差异(P＜0.05)，而模型组和各干预组之间均没有显著性差异(P＞0.05)。经方差分析运动箱实验结果显示，各处理组大鼠rTMS干预后的水平运动距离之间无显著性差异(F= 46．210，P=0.080);强迫游泳实验结果显示，各处理组大鼠rTMS干预后的不动时间百分率均存在显著性差异(F=3．525，P=0.006)。进一步两两比较t检验显示，rTMS干预后对照组不动时间百分比低于模型组(P＜0.05)，5 Hz、0.84 T干预组，5 Hz、1.26 T干预组，10 Hz、0.84 T干预组，10 Hz、1.26 T干预组则高于模型组(P＜0．05，P＜0.01)。见表2。双因素方差分析结果显示，刺激强度的不同水平对强迫游泳不动时间百分比有显著性影响(F=3．243，P=0．049)，而刺激频率对不动时间百分比无显著性影响(F=0．026，P =0．873)，两个因素之间也没有交互作用(F=0．221，P=0.803)。两两比较结果显示，假刺激0 Hz与1 Hz之间存在显著性差异(P＜0.05)，而且与5 Hz和10 Hz之间也存在显著性差异(P＜0.01);此外，1 Hz与5 Hz之间存在显著性差异(P＜0.05)，但是和10 Hz之间无显著性差异(P＞0.05)。

表2rTMS干预后各组大鼠运动箱、强迫游泳实验结果以及BDNF水平的比较(x±s)

2.3 各处理组BDNF水平的比较经方差分析ELISA检测结果显示，各处理组大鼠rTMS干预后的大脑BDNF水平均存在显著性差异(F=3．490，P= 0.040)。进一步两两比较t检验显示，对照组大脑BDNF的水平高于模型组，1 Hz、0.84 T干预组和1 Hz、1.26 T干预组(P＜0.01)，而且5 Hz、0.84 T干预组，5 Hz、1.26 T干预组，10 Hz、0.84 T干预组，10 Hz、1.26 T干预组与模型组比较，也存在显著性差异(P＜0.05)。见表2。双因素方差分析结果显示，刺激强度的不同水平对BDNF有显著性影响(F=3．975，P =0．026)，而刺激频率对不动时间无显著性影响(F= 0．440，P=0．511)，两个因素之间也没有交互作用(F =0．018，P=0.992)。两两比较结果显示，假刺激0 Hz与5 Hz之间存在显著性差异(P＜0.05)，而且与5 Hz和1 Hz之间也存在显著性差异(P＜0.05);此外，1 Hz与10 Hz之间无显著性差异(P＞0.05)。

3 讨论

不同刺激强度和频率的rTMS对大脑皮层兴奋性的影响不同，研究表明，高频刺激(5～20 Hz)可提高治疗侧皮层的兴奋性［7］，而低频刺激(＜1 Hz)对治疗侧皮层兴奋性具有抑制作用［8，9］。临床上，治疗抑郁症常选择高频率rTMS刺激左侧前额叶背外侧皮质，或低频率rTMS刺激右侧前额叶背外侧皮质［10］。但是，目前的研究尚不能揭示如1 Hz、5 Hz或10 Hz等不同高频率对抑郁症的治疗效果之间是否存在差异，不同刺激强度对抑郁症的治疗效果也不清楚。

本研究结果显示，CUS干预后，模型组体质量显著低于对照组(P＜0.05);经过1周的rTMS治疗后，5 Hz、0.84 T干预组，5 Hz、1.26 T干预组，10 Hz、0.84 T干预组，10 Hz、1.26 T干预组大鼠的体质量与对照组没有显著性差异，但是显著高于模型组;1 Hz、0.84 T干预组和1 Hz、1.26 T干预组大鼠的体质量与模型组无显著性差异，但是显著低于对照组。同时，本研究采用强迫游泳和运动箱实验观察不同处理组抑郁行为的差异，结果显示，各处理组大鼠的水平运动距离之间均没有显著性差异，而强迫游泳不动时间的结果与体质量的变化相似:模型组不动时间百分比显著高于对照组(P＜0.05);5 Hz、0.84 T干预组，5 Hz、1.26 T干预组，10 Hz、0.84 T干预组，10 Hz、1.26 T干预组大鼠的不动时间百分比与对照组比较无显著性差异，但是均显著低于模型组;1 Hz、0.84 T干预组和1 Hz、1.26 T干预组与模型组和对照组比较均没有显著性差异。此外，各处理组体质量(4周)经双因素方差分析，频率和刺激强度对其均无显著性影响。提示不同参数rTMS对大鼠体质量的作用并不显著。然而刺激频率对强迫游泳不动时间百分比却有显著性影响，而且0 Hz与1Hz、5Hz或10 Hz之间均存在显著性差异(P＜0.05)，1 Hz与5 Hz之间也存在显著性差异(P＜0.05)，提示rTMS刺激频率而非刺激强度，是改善动物抑郁行为的关键因素，而且5 Hz的抗抑郁效果更好。

为了进一步探讨不同参数rTMS可能的分子机制，本研究观察了各处理组BDNF水平的差异。越来越多的证据表明，BDNF参与了抑郁症的病理生理过程:重症抑郁症(major depressive disorder，MDD)患者血清BDNF的水平低于正常人群，且MDD患者尸检发现大脑BDNF的水平低于健康对照人群［11］;还有研究发现在抗抑郁药物的基础上增加低剂量的非典型抗精神病药物，不仅能增加患者服药的依从性，改善其临床症状，还能增加患者血浆BDNF的水平［12］;而且大鼠海马内注射BDNF能使抑郁模型(强迫游泳和习得性无助)大鼠抑郁样行为得到改善［13］，外周给予BDNF也能产生类似的抗抑郁效应［14］，BDNF已经成为一个重要的抗抑郁效果的候选预测指标［15］。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠BDNF水平显著下降，但给予rTMS干预后，与模型组比较，5 Hz、0.84 T干预组，5 Hz、1.26 T干预组，10 Hz、0.84 T干预组，10 Hz、1.26 T干预组的BDNF水平增加，差异具有统计学意义，表明rTMS干预能明显改善模型大鼠的BDNF水平。双因素方差分析结果也显示，刺激强度的不同水平对BDNF的影响显著，而且5 Hz对BDNF的调节作用更为显著。提示rTMS刺激频率也是改善大鼠BDNF水平的关键因素。

综上所述，本研究发现不同刺激参数的rTMS治疗对大鼠抑郁样行为和BDNF的表达具有差异性，而且刺激频率具有关键作用。为rTMS在抑郁症的临床应用和治疗参数选择提供了实验依据。但本实验的刺激频率只选用了1 Hz、5 Hz和10 Hz，强度也仅选择了0.84和1.26 T，更多的刺激参数组合的抗抑郁作用还不清楚，而且不同rTMS治疗参数对于抑郁症其它相关指标(如神经递质水平、神经发生等)的影响也有待进一步研究。

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(修回日期:2014－02－13)

统计学中有关问题

1.假设检验的注意事项

(1)假设检验应注意资料的可比性。

保证比较组间的可比性是假设检验的前提。为了保证资料的可比性，必须要有严密的抽样设计。

(2)要注意选用的假设检验方法的应用条件。

资料性质不同，设计类型不同，样本含量大小不同，检验方法也不同。

(3)结论不能绝对化。

由于假设检验是根据抽得的样本资料对总体的某种特征作出判断，而样本只反映总体的部分特征，由它来推断总体的特征就不能有百分之百的把握，因此假设检验作出的判断有可能是错误的。

(4)正确区分差别有无统计意义与有无专业上的实际意义。

差别有统计意义只说明相应的总体均数有差别，不说明差别的大小。至于相应总体均数相差多少，有何专业意义，那是另一个概念。

2.什么是小概率原理

小概率原理:发生概率很小的随机事件(小概率事件)在一次实验中几乎是不可能发生的。

根据这一原理，可以先假设总体参数的某项取值为真，也就是假设其发生的可能性很大，然后抽取一个样本进行观察，如果样本信息显示出现了与事先假设相反的结果且与原假设差别很大，则说明原来假定的小概率事件在一次实验中发生了，这是一个违背小概率原理的不合理现象，因此有理由怀疑和拒绝原假设;否则不能拒绝原假设。

检验中使用的小概率是检验前人为指定的。

《精神医学杂志》编辑部

Effect of rTMS with different parameters on behavior and level of cerebral BDNF of chronic unpredictable stress model rats．

LI Ziqing，XUE Fen，CHEN Guanjie，et al．Department of Psychosomatic Medicine，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China

ObjectiveTo investigate the effect of different parameters of rTMS on the behavior and the levels of cerebralBDNF of chronic unpredictable stress ( CUS) model rats.Method64 adult male Sprague Dawley rats were randomly dividedinto sham group ( 8 rats) ，model group ( 8 rats) ，treatment group ( 48 rats averaged into 6 subgroups with different rTMSparameters) . Rats in sham group were treated with fake rTMS for consecutive 7 days after 21－day normal breeding，rats in modelgroup were treated with fake rTMS for consecutive 7 days after successful modeling，and rats in treatment group were treated withrTMS with different parameters according with their subgroup for consecutive 7 days after successful modeling. The body weight ofall rats were recorded weekly. The open field test and forced swimming test were used to evaluate the depression－like behavior.Level of cerebral BDNF was measured by Elisa assay at the end of the study.Results( 1) After successful modeling，therewere significant differences in body weight and immobility time of forced swimming among sham group，model group and treatmentgroup ( P ＜ 0. 01 or 0. 05) . While no significant difference was found between model group and treatment group in body weightand immobility time ( P ＞ 0. 05) . There was no significant difference in distance of horizontal movement among the three groups( P ＞ 0. 05) . ( 2) After the 7－day rTMS or fake rTMS，average body weight in model group was significantly lower than that insham group and in high－frequency treatment group with the parameter of 5 Hz，0. 84 /1. 26 Tesla or 10 Hz，0. 84 /1. 26 Tesla ( P＜ 0. 05) . There was no significant difference in distance of horizontal movement among the three goups，while the immobilitytime of forced swimming was significantly longer in model group than that in sham group and high－frequency treatment group ( P ＜0. 05) . Level of cerebral BDNF in model group was significantly lower than that in sham group，which could be alleviated byrTMS at some parameters. Two－way ANOVA showed that the frequency of rTMS，especially the 5 Hz treatment group，was thekey factor for improving depression－like behaviors and regulating the level of BDNF.ConclusionrTMS with different parametershave different efficacy in improving depression－like behavior of CUS rats. The protein expression of BDNF may be involved in theprocess of improving.

Repetitive transcranial magnetic stimulation ( rTMS) Chronic unpredictable stress ( CUS) Brain derivedneurotrophic factor ( BDNF) Rat

R749.3

A

1009－7201(2014)－02－0123－05

10.3969/j.issn.1009－7201.2014.02.014

2014－01－06)

国家自然科学基金(编号:81171285，81371478)

710032陕西西安，第四军医大学西京医院

谭庆荣，教授，E－mail:tanqingr@fmmu.edu.cn