林锋　李国贤　赵妍　汪虹　陈明杰

摘 要 草菇是一种原产于中国热带与亚热带地区的栽培食用菌，对草菇主要育种方法，包括人工选择育种、杂交育种、诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种及相关分子标记技术，如RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism）、SCAR（Sequence-Characterized Amplified Regions）、草菇交配型基因的分子标记、SSR（Simple Sequence Repeat）、SNP（Single Nucleotide Polymorphism）的研究进展进行了综述，并针对当前存在的问题与现状，对草菇育种今后的发展方向进行了展望。

关键词 草菇；育种方法；分子标记

中图分类号 S646.11 文献标识码A

草菇[Volvariella volvacea（Bull.ex.Fr.）Sing]又名稻草菇、中国蘑菇，在分类学上属真菌门（Eumycetes）、担子菌纲（Basidiomycetes）、伞菌目（Agaricales）、光柄菇科（Pluteaceae）、小苞脚菇属（Volvariella）[1]。草菇原产中国热带与亚热带地区，在台湾、福建、湖南、广东、广西等省（自治区）栽培广泛。2008年中国的草菇年产量达437 200 t[2]，仅广东省的产值就超过1.5亿元[3]。草菇不仅味道鲜美、营养价值丰富，更重要的是作为一种草腐性的食用真菌，能够利用稻草、麦秸、废棉、蔗渣等农业废弃物生产出供人们食药用的子实体，其栽培下脚料还可以制成有机肥料，真正实现了农业固废循环的高效利用，因此近年来草菇生产规模不断扩大，相关产业发展迅速，使其成为一个新的经济增长点。

尽管草菇在中国已有300多年的栽培历史，但仍有许多问题阻碍了产业的发展，如生物转化率低（只有10%～40%）、常规冷藏温度（4 ℃）会引起菌丝体发生自溶、菌种易变异退化等等，因此草菇栽培品种改良成为学者们十分关注的研究课题。由于草菇被认为是一种初级同宗结合的真菌，其菌丝细胞多核且无锁状联合，使得育种者无法从生理形态上区分同核与异核菌丝或亲本与杂交种，导致草菇遗传育种研究进展十分缓慢，只能借助传统的驯化、组织分离、孢子分离等人工选择方法育种[4]。随着分子生物学的发展，尤其是草菇基因组测序的完成，各种分子标记逐步被应用到草菇育种工作中，并获得了一系列高产、优质、抗逆的新菌株。

1 草菇常用育种技术

1.1 人工选择育种

人工驯化、组织分离以及孢子分离是人工选择育种的基本方法，虽然操作简单，却是各种育种方法的基础，并在草菇育种初期获得了一些优良菌株。如李育岳等[5]通过对草菇低温菌株的驯化筛选，获得了菌丝生长与出菇温度均低于原菌株且产量较高、适宜北方栽培的草菇新菌株。组织分离在草菇菌株选育中应用非常广泛，草菇V23、V5菌株便是通过子实体组织分离的方法得到的[3]。孢子分离法主要是利用食用菌成熟的有性孢子萌发成菌丝来获得菌种，其又分为多孢分离与单孢分离两种[6]。多孢分离[7-8]指将许多担孢子一起接入同一个培养基中，让多个担孢子自由萌发结合而得到纯菌种；单孢分离[7]则每次只取1个担孢子，让其萌发得到菌丝体进而获得菌种的方法。邹伯琼、曹裕汉研究发现利用草菇单孢分离得到的菌株，其生长速率普遍快于常规菌株，同时发现草菇孢子分离菌株在菌丝形态、生长速率、产厚垣孢子的能力以及产量等性状上存在较大差异[9-10]。而全面系统地对我国草菇野生资源、栽培品种进行调查、采集、分离、保藏与种性（包括形态特征、生理习性、营养价值、遗传特性）研究，能够使人工选择育种产生更有益的效果。

1.2 杂交育种

杂交育种[7，11]是指通过杂交使亲本的染色体片段交换或者重组而获得新的性状，并在杂交后代中筛选出优良新菌株的方法。该方法的方向性与目的性较为明确，主要着眼于双亲性状间的优势互补或借助其中一个亲本的优点来克服另一亲本的缺点，是遗传物质在细胞水平上重组的一种育种方法。杂交育种的关键在于杂交种真实性的鉴定，常规的判断方法如菌丝体是否双核、是否出现锁状联合等，这些形态学上的鉴定方法在草菇杂交育种中并不适用，主要是由于草菇的菌丝体为多核、无锁状联合且菌落形态多变。研究者也曾试图利用生化标记来鉴定杂交种，如营养缺陷型与同工酶等，但生化标记存在获得较难或受环境因素影响较大等缺陷。近年来随着分子生物学技术在食用菌领域内的不断应用与发展，新型的分子标记为草菇杂交种的鉴定提供了相对较好的途径，使得杂交育种技术成为草菇新菌株选育的一种重要育种手段。

与其它食用菌杂交育种一样，草菇的杂交育种主要指种内不同菌株间进行杂交。福建农林大学谢宝贵等[12]经过三年多的草菇杂交育种试验，经实验室小范围栽培试验与品比试验，均发现杂交菌株“农大1号”的产量显著高于福建省内广泛栽培的V387，属较耐高温的中粒型草菇新菌株。傅俊生等[4]将2个匍匐型不孕的草菇单孢菌株单26、单28进行杂交配对，尖端菌丝细胞分离纯化后获得一气生型菌株2628，菌种鉴定与品比试验的结果表明，菌株2628是一个具有优良性状的杂交新菌株。赵光辉[13]选用草菇菌株V0045分别与V0062、V0073、V0032、V0053（屏优）进行杂交，通过菌株出菇试验，收集农艺性状数据，最终获得了6个草菇优势杂交菌株。

1.3 诱变育种

诱变育种[7，14]是指在育种工作中采用诱变剂引起菌种的遗传性状发生变异，从中挑选出具有优良性状新菌株的方法。根据诱变剂种类的不同，主要分为物理诱变与化学诱变两种方法。物理诱变剂包括非电离辐射类的紫外线、激光与电离辐射类的 χ-射线、γ-射线、快中子等；化学诱变剂主要是烷化剂与碱基类似物，此外还有亚硝酸、吖啶橙、部分金属化合物等。由于诱变育种具有变异效率高、处理方法简单等优点，使其成为菌种选育的一个重要途径。该方法中出发菌株的选择、出发菌株的状态以及诱变剂的种类、剂量和处理时间都对诱变效果产生较大的影响。通常选择生产上性状稳定、优良性状较多的菌株作为出发菌株，并通过一系列的预试验来确定诱变剂的最佳剂量与处理时间。草菇育种中借助诱变育种技术获得的新菌株也越来越多。王波等[15]选用草菇V4菌株作为出发菌株，开展了其原生质体紫外线诱变育种，通过菌丝生长速度、形态特征、营养成分以及产量等方面的比较分析，最终获得了产量较V4菌株高29.1%的优良诱变新菌株Vp53。林瑞虾[16]以草菇菌株屏优一号（PY）、屏优一号的2个单孢菌株PYd15、PYd21及杂交菌株PYd15×PYd21为试验材料，采用60Co-γ射线进行诱变，以产量高于出发菌株、子实体大小优于出发菌株作为筛选条件，最终获得了14株诱变新菌株，其优良性状的遗传稳定性，将在中试试验中进行进一步验证。韩业君等[17]以草菇主栽品种V23菌株作为出发菌株，采用紫外线（UV）、60Co-γ射线、硫酸二乙酯（DES）对其原生质体进行复合诱变，经初筛、复筛后获得耐常规低温（4 ℃）10 d的菌株VH；栽培实验结果表明，VH在26 ℃下的生物转化率显著高于V23，且味道鲜美，是具有应用价值的优良草菇新菌株。

1.4 原生质体融合育种

原生质体融合[7，18]是指将去除细胞壁后不同遗传类型的原生质体，在融合剂（或电场）的诱导下进行融合，实现部分或整套基因组的交换与重组，并产生新品种的过程。由于该方法无需通过食用菌的有性生活史便能获得遗传重组，因此与常规杂交育种相比，原生质体融合育种受亲缘关系的影响较小，为遗传差距较大的远缘杂交提供了可能性。与此同时原生质体融合育种中，融合子的鉴定是限制该技术发展的一个难题，虽然有锁状联合、同工酶分析、生长拮抗试验、出菇试验及担孢子分析等鉴定方法，但均存在一定的问题，仍需找到更可靠的鉴定融合子的方法[19]。在进行草菇原生质体融合育种之前，首先需要探索其原生质体制备与再生的最佳条件。韩业君等[20]研究发现，当溶壁酶浓度2%、温度32 ℃、pH自然、以0.8 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂时，选用菌龄3 d的菌丝酶解2 h，可达到草菇原生质体再生的最佳效果。温海祥等[21]在草菇种内进行了原生质体融合育种的研究，利用草菇不同品种间胞外蛋白酶与淀粉酶活性的差异，对原生质体融合后的再生菌株进行了检测，最终筛选到3个与出发菌株存在显著差异的融合子。但在草菇种间进行原生质体融合时，Zhao等[22]采用AP-PCR鉴定融合子时并未发现双倍体现象，表明草菇种间的原生质体融合较种内而言存在一定的难度。

1.5 基因工程育种

基因工程育种[7，14]是一种在基因水平上的遗传操作，它采用人为手段从供体生物中提取出所需的目的基因，在离体条件下经适当酶切割或修饰后，将其与载体DNA分子连接一并导入受体细胞中进行复制与表达，最终培育出新品种的方法。与常规育种相比，基因工程育种则是以分子生物学理论基础为指导，定向设计基因蓝图并能够实现超远缘杂交的一种育种新技术，该方法可为受常规育种手段制约的食用菌种类的育种带来新的解决途径。目的基因的获取是基因工程育种的前提与基础。目前草菇中有很多基因已被克隆，如内切葡聚糖酶基因eg1[23]、漆酶基因lac1、lac4[24-25]、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因[26]等，而草菇全基因组测序的完成与草菇全基因组框架图的构建[27]大大缩短了目的基因的获取时间，为草菇基因工程育种的发展奠定了坚实的基础。遗传转化与表达系统的建立是基因工程育种的重要环节。目前食用菌上常用的遗传转化方法有PEG法、电激法、基因枪法、农杆菌介导法、限制酶介导法等。郭丽琼等[28]利用基因枪法，将从瑞典北极云杉卷叶蛾幼虫中扩增出的抗冷冻蛋白基因afp遗传转化到草菇中，低温胁迫研究结果显示，转基因草菇及其后代均具有较强的耐低温能力。随后王艺红等[29]采用PEG介导原生质体法，将表达载体pgVvs-mfc与pvg-afp共同转化到草菇菌丝原生质体中，羧甲基纤维素钠酶活和滤纸酶活的试验结果均表明，整合到草菇基因组中的外源多功能纤维素酶基因mfc提高了草菇的纤维素酶活性，最终使得4个转基因草菇菌株的生物转化率都显著高于对照组。王春晖等[30]则以PEG400、CaCl2为诱导剂，将平菇“湘平992”的DNA导入到了草菇“浏阳麻菇”的原生质体中，选育出了在温型、菇型、酶活力以及生物转化率上较亲本有着显著优势的新菌株。

1.6 草菇常用育种技术比较

草菇菌种选育，即选择培育出符合生产实践需要的优良新菌株，取代原有菌株，以提高产量、品质及抗性等。通过比较草菇常用育种技术（表1），可以发现杂交育种技术虽然育种周期较长，但该方法建立在已知性状的亲本间进行杂交，育种的方向性、预见性较好，培育获得新菌株的有效性较强，为草菇的定向育种提供了一定的保证[31]。人工选择育种方法在草菇育种中仍会发挥重要作用，该方法能够从自然界中引入新的优质草菇种质资源。诱变育种与原生质体融合育种由于自身独特的优势，如诱变育种具有变异效率较高的特点，原生质体融合育种则可不经过食用菌有性过程而实现部分或整套基因组的交换与重组等，使二者成为草菇菌种培育的重要途径。基因工程育种的目标性更强，作为一种新型的草菇育种手段，仍需要大量的研究进行不断地完善，随着食用菌基因工程技术的日趋成熟，相信其能够更好地促进草菇育种工作的开展。

2 草菇育种相关分子标记技术

从本质上来讲，分子标记技术是通过检测生物个体在基因或基因型上的变异来反映生物个体间的差异[32]。分子标记技术在食用菌遗传育种中应用广泛，如种质资源评估与菌种鉴定、遗传多样性与亲缘关系分析、遗传连锁图谱构建与基因定位、分子标记辅助选择等方面[33-34]。随着各种分子标记的不断出现与应用，使分子标记辅助育种成为食用菌育种的一个重要技术支撑[35]。由于食用菌的多数农艺性状与商品性状在栽培出菇后才能表现出来，因此常规育种方法不仅费时费力，同时还需要研究人员具备丰富的育种与栽培经验。而利用分子标记技术能够筛选到与优良性状相关的标记，可有效缩短育种周期，提高育种效率，分子标记技术在草菇遗传育种中的应用越来越多。

2.1 RFLP和RAPD标记

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）标记，也被称为第一代DNA分子标记，出现时间最早，是由Bostein D首先提出的基于Southern杂交技术的一种分子标记。该技术使用某一种限制性内切酶切割来自不同个体的基因组DNA或者某一个基因，得到不同长度与数目的酶切片段。由于特异的DNA/限制性内切酶组合所产生的片段是特异的，它可以作为某一DNA的特有“指纹”，直接反映生物的遗传多态性。余志晟等[36]在对12个草菇栽培菌株DNA多态性分析的研究中，应用PCR-RFLP技术，扩增了rDNA5.8s+ITS区段及mtDNA小区段，并进行限制性酶切分析，结果表明草菇菌株间的rDNA在5.8s+ITS区段的遗传差异小，据此只能将所测试的12个草菇菌株分为2类；而在mtDNA小区段的检测中没能显示出差异，表明该区段上所测试草菇菌株遗传相似性很高。

RAPD（Random Amplified Polymolphic DNA）即随机扩增多态性DNA，由美国人Williams等于1990首次提出。该技术以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10个碱基对）为引物，在热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）作用下进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性，扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。邓旺秋等[37]对广东省主要栽培的8个草菇菌株进行了RAPD多态性分析，获得了这8种草菇菌株的DNA指纹图谱，构建得到的聚类图表明：RAPD标记对草菇菌株的分类与草菇形态学上的分类结果基本一致，说明RAPD标记能够分辨出草菇不同菌株并可快速有效地鉴定草菇商业菌株。余志晟等[36]在对草菇栽培菌株的RAPD分析中指出，RAPD标记技术结合聚类分析可以为草菇育种工作提供科学依据，研究结果还表明所测试的草菇菌株遗传相似度较高，并建议为了更好地促进草菇育种，需要寻找新的草菇种质资源。徐学锋等[38]选用20条随机引物分别对14个草菇菌株进行PCR扩增，研究结果表明：RAPD方法对探索草菇有性世代间的遗传分离规律有着重要价值。陈剑等[39]也利用RAPD技术对草菇杂交后代进行鉴定，发现不同引物的鉴定效果有差异，同时也证明RAPD技术可以用于鉴定草菇杂交后代。RAPD技术不仅在草菇育种中起重要作用，在其它食用菌育种中也应用广泛。上官舟建等[40]利用RAPD技术分析了3株新选育的真姬菇菌株，从分子水平上验证了新菌株遗传基因间的差异。尚晓冬等[41]从国内外收集了19株杏鲍菇菌株并进行了RAPD指纹图谱分析。此外RAPD标记在平菇[42]、杏鲍菇[43]、凤尾菇[44]以及双孢蘑菇[45]等食用菌中也有相关研究报道。

2.2 SRAP和SCAR标记

SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism）即序列相关扩增多态性，是一种基于PCR的新型标记。该标记的基本原理：利用基因外显子内G、C含量丰富，而启动子与内含子里A、T含量丰富的特点设计一对引物，对开放阅读框架进行扩增[46]。SRAP标记以其稳定、简便、产率高、便于目标片段克隆等优点，自创建以来已被广泛应用于图谱构建[47]与遗传多样性分析[48-50]。傅俊生等[4]将SRAP与RAPD技术相结合成功鉴定了草菇杂交种2628，在该杂交菌株中共发现4个SRAP特异遗传标记，其中1个来自于亲本单孢26，另外3个来自于亲本单孢28。SRAP标记除用于草菇育种外，还被用于凤尾菇菌株的鉴定[44]。

SCAR（Sequence-Characterized Amplified Regions）于1993年由Paran与Michelmore首次提出，该标记技术是在RAPD基础上发展起来的。SCAR的基本步骤：首先需要进行RAPD分析，把目的RAPD片段进行克隆、测序，然后根据测序结果即原RAPD片段两末端序列设计的特定引物，最后用此引物对基因组DNA再次进行扩增与分析。与RAPD及其它利用随机引物的标记技术相比，SCAR具有更好的重复性，并且可通过扩增带的有无来判断待测样品间的差异，该分子标记技术在植物遗传多样性、品种鉴定、性别鉴定等方面应用广泛[51-54]。在草菇杂交育种鉴定中，傅俊生等[55]先借助SRAP技术筛选出草菇亲本单26与亲本单28的4条遗传差异条带，并将其成功转化为SCAR遗传标记，应用这4个SCAR标记成功鉴定了草菇菌株2628的杂种性。在真姬菇杂交育种研究中，Lee等[56]对9个真姬菇菌株进行遗传多样性分析后获得了10个特异性片段，进而设计了10条引物，最终试验结果表明使用其中的4条引物便能够成功地鉴定出杂交菌株，说明SCAR标记在真姬菇杂交种鉴定中方法可行。

2.3 草菇交配型基因分子标记

汪虹等[57]以草菇交配型基因为分子标记，发明了一种快速筛选草菇杂交菌株的方法，该方法包括：（1）比较草菇单孢分离菌株交配型A位点的基因序列，根据基因序列的保守性，对不同草菇单孢分离菌株设计并合成特异性引物；（2）将草菇单孢分离菌株用PDA培养获得菌丝体，使用定制的试剂盒检测草菇菌株的交配型基因类型；（3）将已确定交配型基因类型的菌株两两接种在PDA培养基上培养，待菌落相交时，分别从两个菌落的外侧挑取菌块转移至试管培养基上进行3次继代培养；（4）使用预先设计的交配型特异性引物，对草菇杂交后的菌株进行PCR扩增，研究表明杂交菌株能扩增出针对两个母本交配型的2个条带，而单孢菌株只能扩增出1个条带。与常规的形态学检测、拮抗试验、出菇试验等方法相比，该方法具有操作简便、检测时间短、准确性高等优点，在草菇杂交育种研究中具有良好的应用前景，能够推动草菇杂交育种工作更好地向前发展。

2.4 SSR和SNP标记

SSR（Simple Sequence Repeat）也称为微卫星DNA（microsatellite DNA）、短串联重复（tendom-repeats）、简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism）等，通常是以2～3个（少数为1～6个）核苷酸为单位的多次串联重复的DNA序列。一般每个SSR两端的序列是相对保守的单拷贝序列，通过这段序列可以设计一段互补的寡聚核苷酸引物，对SSR进行PCR扩增，由于SSR多态性多由简单序列重复次数的差异引起，通常表现为共显性[58]。SSR扩增产物通常采用高浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。该标记技术在植物遗传图谱构建上已有应用[59]，在食用菌中也有相关的研究应用。Zhang等[60-61]将SSR技术成功地应用于金针菇与黑木耳的菌株鉴定工作中，分别建立起10个金针菇的SSR标记与17个黑木耳的SSR标记。许占伍等[62]研究特异SSR标记H35在真姬菇中的可传递性，他们以SIEF3133菌株的原生质体单核体、孢子单核体及与SIEF3136菌株孢子单核体的杂交菌株为试验材料，结果表明SSR标记H35与交配型因子A2间具有连锁性，并能跟踪含有A2交配型单核体的杂交菌株。

SNP（Single Nucleotide Polymorphism）即单核苷酸多态性，指由于单个核苷酸的变异而导致基因组水平上DNA序列的多态性，主要有单碱基的缺失、插入、转换及颠换等。作为第三代分子标记技术，SNP具有遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛、富有代表性、二态性与等位基因性、易实现自动化分析等特点，使其在动植物遗传育种中发挥着越来越重要的作用[63-65]，但目前其在真菌尤其在食用菌遗传育种上应用相对较少，可能在未来有着广阔的应用前景。

3 展望

草菇作为一种营养丰富、经济价值较高的食用菌，其商业化种植越来越广泛。作为高温出菇的草菇，存在低温贮藏时受冷害严重[66]、采后易开伞导致品质下降、生物转化率低等缺点，为了更好地促进草菇产业的发展，选育出优质的草菇新菌种迫在眉睫。纵观草菇常用的育种方法，笔者认为杂交育种虽然育种周期较长，但是其育种目标的预见性与方向性较好，在较长的一段时间里可能仍是草菇育种的主要手段，当然草菇育种想要更好地发展也离不开其它育种方法的同步进行。值得一提的是，基因工程育种技术能够通过导入优良基因，选育出符合生产上需要的草菇新菌株，使其可能成为今后草菇育种工作中的研究热点。由于草菇菌丝多核且无锁状联合，这在很大程度上制约了草菇新菌株的鉴定，分子标记技术的应用为草菇新菌株的选育提供了一条有效的途径。随着草菇全基因组测序的完成与框架图的构建[27]，各种分子标记（如草菇交配型基因）将会更好地为草菇遗传育种工作服务。新兴的分子标记技术，如SSR与SNP，虽然在草菇育种中尚未有相关研究报道，但是其在动植物和部分食用菌上已有一定的研究进展，相信随着科学研究的不断深入，这些高通量的分子标记技术将被广泛用于草菇种质遗传多样性分析、杂交子或融合子鉴定、遗传连锁图谱构建与基因定位等方面，最终会给草菇遗传育种工作带来巨大进步。

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