韩梅梅　杨晓帆　王军　潘秋红

摘 要 利用高效液相色谱-质谱技术，分析3个酿酒葡萄品种（美乐、品丽珠、赤霞珠）不同品系及同一品系（赤霞珠338）不同定植地点葡萄果皮中的花色苷种类与含量。结果表明：同一品种不同品系之间花色苷种类相似，但花色苷含量有所差异，差异程度取决于葡萄品种；‘美乐348总花色苷含量显著高于‘美乐181，且其花翠素类花色苷含量明显高于其他3个品系，品系间大部分花色苷含量差异显著；尽管‘品丽珠和‘赤霞珠各品系在花色苷总量和花翠素类花色苷上没有明显差异，但这2个品种的品系之间有少数基本花色苷含量呈现显著性差异；同一品系不同定植地点，果实花色苷总量和组成比例都存在较大差异。结果说明果实中各种花色苷组成比例既依赖于品种，也受品系和产地的影响，且产地因素的影响大于品系。

关键词 花色苷；品系；定植地点；酿酒葡萄

中图分类号 Q946.83+6 文献标识码 A

花色苷是红色葡萄品种及红葡萄酒的主要呈色物质，其种类与含量决定了葡萄与葡萄酒的呈色[1]。葡萄酒中的花色苷主要来源于葡萄果实，在葡萄酒陈酿过程中，花色苷还可以与单宁等其它物质作用，进而影响葡萄酒的色泽与口感[2-3]。此外，花色苷具有抗氧化和清除自由基的生理活性[4-5]，是葡萄酒保健功效的贡献者之一。因此，葡萄果实中的花色苷对葡萄酒的颜色、口感、营养价值等多方面有作用。

葡萄果实花色苷的生物合成有2个分支：一个是类黄酮-3′-羟基化酶（F3′H）介导的花青素类花色苷的合成途径，另一个是类黄酮-3′5′-羟基化酶（F3′5′H）介导的花翠素类花色苷的合成途径[6]（图1）。这2类花色苷主要差异在于B环取代基数目的不同，花青素类是3′和4′取代，而花翠素类为3′、4′和5′取代，其最大吸收波长分别为516～525 nm，二者可分别使葡萄果皮呈现紫红色和紫罗兰色/蓝色色调[7]。B-环上取代基数目越多，花色苷越偏向于蓝色色调[8]。因此，花色苷种类与含量在很大程度上决定了葡萄酒的色泽，进而影响葡萄酒的感官质量。

欧亚种（Vitis Vinifera L.）酿酒葡萄总花色苷中B-环3′5′-位取代花色苷所占比例远高于B-环3′-位取代的花色苷，并且主要以甲基形式取代[9]。中国主要红色酿酒品种有赤霞珠、品丽珠、蛇龙珠及美乐等欧亚种，果实花色苷种类与含量不仅取决于自身基因型，而且受如温度、光照、水分和土壤养分等环境条件强烈影响[10-15]，使得同一品种在不同地区展现出不同花色苷指纹。关于葡萄果实花色苷的研究，以往的报道主要集中于不同葡萄品种之间的比较，环境条件及生长调节剂对花色苷积累的影响以及花色苷生物合成与调控[6，13，16-18]，而对同一品种不同品系之间的花色苷关注较少。

品系是指品种内的不同类型，或在育种过程中，表现较好，但还没有成为品种之前的变异类型[19]。同一葡萄品种不同品系之间花色苷指纹有何差异？品系之间的差异在不同品种之间是否有共性？在不同定植地点同一品系花色苷指纹又有何不同？本研究采用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）技术分析了3个常见酿酒葡萄品种美乐、品丽珠和赤霞珠的不同品系中花色苷的种类及含量，找出其异同点，为新品系的推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 品系 参试材料为美乐（Vitis vinifera L. Merlot）4个品系181、343、346和348；品丽珠（Vitis vinifera L. Cabernet Franc）2个品系327和409；赤霞珠（Vitis vinifera L. Cabernet Sauvignon）3个品系170、338和685；这些品系均在2006年定植于河北昌黎华夏长城葡萄酒公司华夏母本园，参照上一年葡萄商业采收期，结合当年的气候状态，分别于2009年9月21日、10月5日和10月14日取样，为使取样具有代表性，按Boulton等[20]所述方法摘取百粒果，采后存放于泡沫盒内，于当天运回实验室。

1.1.2 栽培环境条件 不同定植地点葡萄花色苷差异的研究所用样品为‘赤霞珠338，取样地点分别为华夏长城葡萄酒公司位于河北省抚宁县吴官营村葡萄园的4个地块，分别以‘低洼、‘高坡、‘门前、‘屋后代称。吴官营村北靠森林，东西相接英山河水库，3面群山环抱，坡度较高，北坡向阳，日照充足，昼夜温差大，无霜期195 d左右，年降雨量550 mm；葡萄园为南北行向，行株距为2.5 m×0.6 m。本研究中‘低洼与‘高坡地块主要是坡度的差异，‘门前地块为向阳面，光照充足，‘屋后为阴面，其它栽培条件一致，即不同地块主要是坡向不同，导致葡萄园持水与受光存在较大差异。所有样品均达到商业采收期，且成熟度较一致。采样方法同上。

1.2 方法

1.2.1 葡萄果皮中花色苷的提取 将葡萄样品果皮剥离并用液氮研磨，冷冻干燥，干燥后的粉末于-40 ℃冰箱中保存备用。（1）称取葡萄皮干粉0.5 g置于三角瓶中；（2）加入10 mL含2%甲酸甲醇提取液，超声萃取10 min，于25 ℃下避光以150 r/min震荡萃取30 min，然后以8 000 ×g离心10 min，转移上清液于100 mL圆底烧瓶中，重复提取5次；（3）合并上清液，经30 ℃真空旋转蒸发除去甲酸和甲醇，用定容剂（流动相A ∶ B=9 ∶ 1）重新溶解并定容至10 mL，以0.22 μm水系膜过滤上样。

1.2.2 HPLC-ESI-MS分析 采用Agilent 1100系列配有二极管阵列检测器（DAD）的LC/MSD Trap-VL液相色谱-离子阱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）进行样品分析，MSD包括电喷雾离子源和离子阱质谱检测器，所有部件均由安捷伦v.5.2化学工作站控制。色谱柱：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm）；流动相A ∶ 水 ∶ 甲酸 ∶ 乙腈=92 ∶ 2 ∶ 6（V ∶ V ∶ V），流动相B ∶ 水 ∶ 甲酸 ∶ 乙腈=44 ∶ 2 ∶ 54（V ∶ V ∶ V）；流速：1.0 mL/min；柱温：50 ℃；进样量：30 μL；检测波长：525 nm。

1.2.3 花色苷定性定量方法 （1）定性分析：基于本实验室建立的“葡萄与葡萄酒花色苷 HPLC-UV-MS/MS指纹谱库”的基础上，通过对样品HPLC-UV-MS/MS图谱中质谱信息、光谱信息和保留时间与谱库比对分析，确定花色苷组分。

（2）定量分析：以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷为标准物，建立5～500 mg/L之间9个水平、3个重复的标准曲线，线性回归系数在0.999以上，进行外标法定量，所有花色苷均以相当于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量计。果皮中花色苷含量均用mg/g（每克干果皮中所含花色苷的毫克数）表示。

1.3 数据统计分析

每个葡萄样品均进行3个独立的提取，以获得3个重复，以独立方差T检验进行两两差异显著性分析，使用邓肯式多重比较进行3个以上样品差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 不同品系葡萄果皮花色苷总量的比较

从图2可看出，对于不同葡萄品种，品系间花色苷含量组成不同。‘美乐348果皮中总花色苷含量显著高于‘美乐181，这主要是由于该品系含有很高的花翠素类花色苷。而‘美乐343和‘美乐346与‘美乐348相比，在总花色苷含量上没有显著性差异，但花青素类花色苷含量明显较高。这些结果说明在‘美乐348果皮花色苷合成途径中，碳源更多地流向F3′5′H支路而生成花翠素类花色苷；‘美乐181果皮中的花色苷类物质含量在4个品系中最低。

‘品丽珠327和‘品丽珠409果皮中的总花色苷、花翠素类花色苷及花青素类花色苷含量均没有显著性差异。对于‘赤霞珠的3个品系，总花色苷和花翠素类花色苷含量没有统计学上的显著性差异，但‘赤霞珠338花青素类花色苷含量高于‘赤霞珠170和‘赤霞珠685。

此外还可以看出，‘品丽珠与‘赤霞珠果皮中各类花色苷的含量比例相似，花青素类花色苷占总花色苷的10%左右。除了‘美乐348中花青素类花色苷占总花色苷的17%以外，美乐其它品系花青素类花色苷所占比例达到20%以上，且除‘美乐181以外，‘美乐其它品系的花色苷总量高于‘品丽珠与‘赤霞珠。

2.2 不同品系葡萄果皮各种花色苷含量的比较

品系之间花色苷种类差别不大。从表1～3可以看出，除‘赤霞珠338没有检测到甲基花翠素-3-O-6-反式香豆酰化葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-6-反式香豆酰化葡萄糖苷以外，其它所有样品均检测到16种花色苷。

在‘美乐4个品系中，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，占花色苷总量的20%以上。其次含量较高的依次是甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-6-乙酰化葡萄糖苷及二甲花翠素-3-O-6-反式香豆酰化葡萄糖苷。在‘美乐348果皮中后两者含量显著高于甲基花青素-3-O-葡萄糖苷，并且显著高于其它3个品系；‘美乐343和‘美乐346果皮中的甲基花青素-3-O-葡萄糖苷含量显著高于‘美乐181与‘美乐348。这4种花色苷占 ‘美乐总花色苷含量的一半以上，是‘美乐葡萄的主要花色苷。‘美乐348葡萄果皮中的4种主要花色苷含量之和显著高于另外3个品系。除了甲基花翠素-3-O-6-顺式香豆酰化葡萄糖苷之外，其它15种花色苷的含量在品系之间或多或少都存在差异（表1）。

就‘品丽珠而言，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷占花色苷总量的30%以上，其次是二甲花翠素-3-O-6-乙酰化葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-6-反式香豆酰化葡萄糖苷及甲基花青素-3-O-葡萄糖苷。‘品丽珠327中除了甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和花翠素-3-O-葡萄糖苷含量显著高于‘品丽珠409以外，其他花色苷物质在2品系之间均没有显著性差异。另外，4种主要花色苷占 ‘品丽珠总花色苷含量的70%以上，其含量之和在‘品丽珠327与‘品丽珠409之间也没有显著性差异（表2）

与‘美乐和‘品丽珠相似，‘赤霞珠果皮中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，占总花色苷含量的40%以上，其次为二甲花翠素-3-O-6-乙酰化葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-6-反式香豆酰化葡萄糖苷；除‘赤霞珠338中甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-6-乙酰化葡萄糖苷和花翠素-3-O-6-香豆酰化葡萄糖苷含量显著高于‘赤霞珠170和‘赤霞珠685以外，其它花色苷在‘赤霞珠3个品系间均无显著性差异（表3）。

以上结果表明，‘美乐各品系之间大部分花色苷存在显著性差异，而‘品丽珠和‘赤霞珠中，各品系之间只有2～4种主要花色苷存在统计学的显著性差异，其它大部分花色苷差异不明显，说明葡萄果实花色苷含量既依赖于品种也依赖于品系，品系的影响相对要小得多。

2.3 不同定植地点‘赤霞珠338果皮花色苷含量的比较

各地块种植的‘赤霞珠338在花色苷组成比例上也存在一定差异（图3），4个地块中，‘屋后地块‘赤霞珠338中的总花色苷含量最高，表现为花翠素类和花青素类花色苷含量均很高，且均显著高于‘低洼地块样品，在总量上与其它2地块没有显著性差异。

所有地块样品均检测到16种花色苷（表4），‘屋后地块葡萄果皮中，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-6-乙酰化葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-葡萄糖苷等4种花色苷的含量显著高于‘低洼地块，这4种花色苷含量占了总量的70%。其它种类的花色苷在不同地块之间也存在差异。与品系因素的影响相比，葡萄种植环境对花色苷组成比例的影响相对较大。

3 讨论与结论

本研究表明，葡萄品系之间花色苷含量存在差异，其差异程度取决于葡萄品种。‘品丽珠和‘赤霞珠各品系之间只有少数基本花色苷存在显著性差异，而‘美乐各品系之间大部分的花色苷存在明显差异。这与何建军[7]研究结果一致，其报道指出欧亚种葡萄中‘美乐品种的F3′H途径较为活跃；而‘美乐品系间花色苷含量的差异主要与类黄酮途径中碳源更多地流向F3′5′H分支途径有关。

不同定植地的土壤及微气候对果皮花色苷含量的影响可能更大。对于同一品系，不同地块生长的果实中各种花色苷的含量存在较大差异。本研究表明这种差异主要在于整个类黄酮代谢的强弱，类黄酮代谢中2个分支路径的影响程度相似。有研究显示，灌溉过量会使花色苷浓度降低，而水分缺失则导致花色苷含量升高[13，15，21]；低温可以促进花色苷的合成，光照过强对花色苷有抑制作用[10-11，22-23]。本研究中‘屋后地的果实，其花色苷合成的2个分支途径的产物均显著高于‘低洼地生长的果实，这是由于‘屋后地块温度较低，‘低洼地块光照过强且易积累水分等因素造成的。

葡萄果实中花色苷的合成会受到基因型和环境因素等多方面的影响[24]。不同品种或品系的葡萄，由于其基因型的差异会影响花色苷物质的含量和种类；而不同定植地点的同一葡萄品种或品系，由于光照、温度、水分条件等差异也会导致花色苷含量有所差异。因此，针对不同的品种、品系特点，合理选择定植区域，才能发挥其优势。

参考文献

[1] Mazza G， Francis F J. Anthocyanins in grapes and grape products[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 1995， 35（4）： 341-371.

[2] González-Manzano S， Duenas M， Rivas-Gonzalo J C， et al.Studies on the copigmentation between anthocyanins and flavan-3-ols and their influence in the colour expression of red wine[J]. Food Chemistry， 2009， 114（2）： 649-656.

[3] Monagas M， Bartolomé B， Gómez-Cordovés C. Evolution of polyphenols in red wines from Vitis vinifera L. during aging in the bottle[J]. European Food Research and Technology， 2005， 220（3-4）： 331-340.

[4] De Gaulejaca N S-C， Gloriesb Y， Vivas N. Free radical scavenging effect of anthocyanins in red wines[J]. Food Research International， 1999， 32（5）： 327-333.

[5] de Pascual-Teresa S， Sanchez-Ballesta M T. Anthocyanins： from plant to health[J]. Phytochemistry Reviews， 2008， 7（2）： 281-299.

[6] He F， Mu L， Yan G-L， Liang N N， et al. Biosynthesis of anthocyanins and their regulation in colored grapes[J]. Molecules， 2010， 15（12）： 9 057-9 091.

[7] 何建军. 影响酿酒葡萄果实中花色苷结构修饰的因素分析[D].北京： 中国农业大学， 2010.

[8] 李 华， 王 华， 袁春龙，等. 葡萄酒化学[M]. 北京： 科学出版社， 2005： 108.

[9] 刘闯萍， 王 军. 葡萄花色苷的生物合成[J]. 植物生理学通讯， 2008， 44（2）： 363-377.

[10] Bergqvist J， Dokoozlian N， Ebisuda N. Sunlight exposure and temperature effects on berry growth and composition of Cabernet Sauvignon and Grenache in the central San Joaquin Valley of California[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 2001， 52（1）： l-7.

[11] Cohen S D， Tarara J M， Kennedy J A. Assessing the impact of temperature on grape phenolic metabolism[J]. Analytica Chinica Acta， 2008， 621（1）： 57-67.

[12] Kliewer W M. Influence of temperature， solar radiation and nitrogen on coloration and composition of Emperor grapes[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 1977， 28（2）： 96-103.

[13] Jackson D I， Lombard P B. Environmental and management practices affecting grape composition and wine quality-A Review[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 1993， 44（4）： 409-430.

[14] Reay P F， Fletcher R H， Thomas V J. Chlorophyll， carotenoids and anthocyanin concentrations in the skin of “Gala” apples during maturation and the influence of foliar applications of nitrogen and magnesium[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 1998， 76（1）： 63-71.

[15] Roby G， Harbertson J F， Adams D A， et al. Berry size and vine water deficits as factors in winegrape composition： anthocyanins and tannins[J]. Grape and Wine Research， 2004， 10（2）： 101-107.

[16] Cortell J M， Kennedy J A. Effect of shading on accumulation of flavonoid compounds in（Vitis vinifera L.）Pinot Noir fruit and extraction in a model system[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry， 2006， 54（22）： 8 510-8 520.

[17] Downey M O， Dokoozlian N K， Krstic M P. Cultural practice and environmental impacts on the flavonoid composition of grapes and wine： A Review of Recent Research[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 2006， 57（3）： 257-268.

[18] Pomar F， Novo M， Masa A. Varietal differences among the anthocyanin profiles of 50 red table grape cultivars studied by high performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A， 2005， 1 094（1-2）： 34-41.

[19] 张振文， 刘延琳， 贺普超， 等. 葡萄品种学[M]. 陕西： 西安地图出版社， 2000： 2.

[20] Boulton R B， Singleton V L， Bisson L F， et al. Principles and practices of winemaking： Selection of state of ripeness for harvest and harvesting[M]. New York： Chapman & Hall， Interational Thomson Publishing， 1995.

[21] Kennedy J A， Matthews M A， Waterhouse A L. Effect of maturity and vine water status on grape skin flavonoids[J].American Journal of Enology and Viticulture， 2002， 53（4）： 268-274.

[22] Spayd S E， Tarara J M， Mee D L， et al. Separation of sunlight and temperature effects on the composition of Vitis vinifera cv. merlot berries[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 2002， 53（3）： 171-182.

[23] Steyn W J， Holcroft D M， Wand S J E， et al. Anthocyanin degradation in detached pome fruit with reference to preharvest red color loss and pigmentation patterns of blushed and fully red pears[J]. Journal of The American Society For Horticultural Science， 2004， 129（1）： 13-19.

[24] Ortega-Regules A， Romero-Cascales I， Lopez-Roca J M， et al. Anthocyanin fingerprint of grapes： environmental and genetic variations[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2006， 86（10）： 1 460-1 467.