摘 要 采用染色体压片法研究甘蔗属热带种与滇蔗茅远缘杂交F1代花粉母细胞减数分裂过程及染色体行为，显微观察结果显示：在终变期观察到单价体、二价体和四价体；分裂中期Ⅰ、后期Ⅰ、中期Ⅱ和后期Ⅱ均出现落后染色体；中期Ⅱ形成“八”字形纺锤丝、后期Ⅱ二分体2个子细胞染色体不同步分离；四分体时期观察到三分体、微核、大小不等的四分体以及多面体等异常细胞；同一小花的3个花药中几个不同时期的分裂相同时存在。进一步应用DAPI荧光染料进行染色观察，结果表明，大多数小孢子在单核时期就发生皱缩变形。该结果说明减数分裂过程异常染色体行为和异常细胞分裂是导致杂交F1代花粉完全败育的主要原因。花粉败育时期为小孢子母细胞时期、四分体时期和单核小孢子时期。

关键词 甘蔗；滇蔗茅；杂交F1代；花粉败育；减数分裂

中图分类号 Q23 文献标识码 A

Abstract The cytological smear techniques was used for studing the meiosis and chromosome behavior of pollen mother cells in Sugarcane officinarum × Erianthus rockii F1 hybrids. The results from microscope observation revealed some abnormal behaviors in meiosis as follows： ①The univalents， bivalents and quadrivalents were observed in diakinesis； ②A few lagging chromosomes appeared in metaphase Ⅰ， anaphase Ⅰ， metaphase Ⅱ and anaphase Ⅱ； ③The back arch shaped spindle in metaphase Ⅱ and the Daughter cell chromosomes in dyad were out of sync separation in anaphase Ⅱ； ④There were some abnormal cells in tetrad stage， such as traid， micronucleus， different sized tetrad and polyhedron etc； ⑤Different cell division phase co-existed in the three anthers in one flower. Another results from DAPI staining method indicated that most microspores came into shrinkage deformation in the uninucleate stage. Ultimately， it can be concluded that the chromosome abnormal behavior and the cell abnormal division in meiosis should be the main reason for the pollen abortion completely of F1 hybrids， and the pollens abortion couble be occurred in the stage of microspore mother cell， tetrads and uninucleate microspore.

Key words Sugarcane； Erianthus rockii； F1 hybrid； Pollen abortion； Meiosis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.020

甘蔗是中国乃至世界最重要的糖料作物[1]。甘蔗属包括了热带种（Saccharum officinarum）、中国种（S. sinense）、印度种（S. barberi）、细茎野生种（S. spontaneum）和大茎野生种（S. robustum）等。甘蔗属染色体极为复杂（具高度多倍体化且为非整倍体），该属成员含2n=40～200和现代栽培品种100～130条染色体[2-3]。甘蔗存在不规则的减数分裂类型，这种不规则的减数分裂有助于形成非整倍体配子，染色体大部分以二价体进行配对[2，4]。甘蔗属热带种是蔗糖分的主要基因来源，典型的热带种染色体数目2n=80，其减数分裂存在下述情形：某些带有规则二价体的无性系能够进行正常的减数分裂；有的有较低频度的减数分裂异常体（例如出现少量单价体）；有的在减数分裂时出现相当高量的异常体，例如常出现单价体、落后染色体、桥体和纺锤体异常[5]。在甘蔗育种上常以热带种为主体亲本与其他种尤其是细茎野生种和印度种杂交，产生的后代经过数次回交或杂交获得现代甘蔗栽培品种，用于蔗糖加工生产。但因甘蔗各类型种质不易开花，花期差异大，能作亲本利用的材料较少，长期的近亲杂交导致现代甘蔗品种的遗传基础狭窄，从而限制了品种生产力的进一步提高[6]。利用甘蔗与野生种进行远缘杂交是甘蔗品种改良和种质创新的重要途径之一[7-9]，通过不断创新种质期望能选育出突破性新品种。

滇蔗茅（Erianthus rockii Keng）属于蔗茅属，是甘蔗属的近缘植物资源，在中国主要产于四川、云南、西藏；多生于海拔500～2 700 m的干燥山坡草地[10]。目前国家甘蔗种质资源圃（云南省开远市）保存有50多份滇蔗茅资源，蔡青等的研究结果表明，滇蔗茅与甘蔗亲缘关系较近[11-12]，滇蔗茅种间遗传多样性非常丰富[13]，同时具有抗锈病强的优良特性[14-15]，已成为甘蔗育种工作者理想的抗锈病亲本。20世纪90年代，广西甘蔗研究所开始对滇蔗茅进行远缘杂交利用[16-17]，但至今还没有创制出高世代的含滇蔗茅血缘材料。近年，云南甘蔗研究所通过光周期室调控技术诱导优质的甘蔗属热带种孕穗开花，与近缘属种滇蔗茅进行远缘杂交利用，获得杂交F1和BC1代植株[18-20]，并且采用先进的分子标记技术对杂交后代进行真实性鉴定[21-22]。林秀琴等对滇蔗茅及其杂交F1代染色体进行分析，结果表明，滇蔗茅体细胞染色体数目2n=30[23]，当与热带种杂交时，双亲本染色体以n+n方式进行遗传[24-25]。但是，滇蔗茅与热带种远缘杂交F1代植株花粉高度不育，其机理还不清楚，导致杂交F1代用作父本去改良现有甘蔗品种的难度较大，极大地阻碍了滇蔗茅种质资源优异性状的挖掘利用。为了探讨杂交F1代花粉败育的原因，本文采用染色体压片方法对8个杂交F1代花粉母细胞减数分裂过程进行显微观察，较详细地分析了花粉母细胞减数分裂过程各时期的细胞学特征，进一步采用DAPI荧光染料对花粉粒细胞核进行染色观察，以判断杂交F1代植株花粉败育的时期。

1 材料与方法

1.1 材料

以甘蔗属热带种（路打士）和蔗茅属滇蔗茅（云南95-19）的杂交F1代为实验材料，材料经SSR分子标记鉴定均为真实的杂交后代[21]，该材料由国家甘蔗种质资源圃提供。

1.2 方法

1.2.1 取样及预处理 在材料孕穗的中后期适时取样，选取幼穗上、中、下部位的小花进行混合，用卡诺氏固定液Ⅰ固定24 h（4 ℃冰箱中），双蒸水洗2次，每次10 min，转入70%酒精4 ℃冰箱中长期保存，用于后面花粉母细胞减数分裂过程制片和DAPI染色观察。

1.2.2 制片方法与普通细胞学分析 采用染色体压片法进行制片，将小花从70%乙醇中取出，用滤纸吸干溶液后放在一干净的载玻片上，用解剖针将花药挑出，滴1滴改良苯酚卡宝品红染色液，迅速用镊子将花药壁捣碎，使花粉母细胞溢出，除去花药壁和组织残渣，加盖玻片，轻轻敲片，压片，用滤纸吸掉多余的染色液，在蔡司Axioskop 2 plus显微镜下观察各时期分裂相并拍照。根据Sapra等[26]的方法来统计其减数分裂指数，即减数分裂指数=（末期Ⅱ（四分体）的正常细胞数/末期Ⅱ观察细胞总数）×100，减数分裂指数为90～100代表遗传稳定。

1.2.3 DAPI荧光染料染色观察 取相对成熟的花药放在一干净的载玻片上，用解剖针将其捣碎，滴1滴DAPI溶液（2 μg/mL），避光染色7 min，再滴1滴抗荧光衰减剂进行封片，在蔡司荧光显微镜下观察小孢子发育状况。

1.2.4 花粉育性观察 在田间取成熟的花粉带回实验室，用1%碘一碘化钾染色液进行染色，然后在显微镜下观察，每个材料观察5个视野，每个材料至少观察200个成熟花粉粒，统计可育花粉和不育花粉的数目。花粉呈圆形且染色深的为可育花粉，反之染色浅的或形状不规则的为不育花粉。

2 结果与分析

2.1 杂交F1代花粉母细胞减数分裂观察结果

2.1.1 前期Ⅰ 在减数分裂前期Ⅰ的细线期，染色体呈细线状，具有念珠状的染色粒。染色体细线交织在一起成团，偏向核的一方，DNA复制完成，核仁清晰可见（图1-A）。偶线期同源染色体开始配对重组（图1-B）。至粗线期，核仁仍然可见，染色体逐渐缩短变粗，同源染色体配对及遗传物质交换完成（图1-C）。双线期的染色体进一步浓缩，可见交叉结和交叉端化（图1-D、E）。终变期可识别染色体构型，染色体构型以棒状为主，此时还观察到单价体、双价体和四价体（图1-F；图2-A、B）。

2.1.2 中期Ⅰ～末期Ⅰ 减数分裂中期Ⅰ，染色体密集地排列在赤道板上，由于染色体小、数目多，此时的染色体构型比较难判断（图1-G）。在中期Ⅰ细胞中观察到散落在赤道板外的单价体和二价体（图2-C、D），形成中期Ⅰ落后染色体，这种异常细胞的比例约占35%。同时，在后期Ⅰ和末期Ⅰ，均观察到落后染色体（图2-E、F、G），可能是由于中期Ⅰ落后染色体继续落后，且在每个细胞中落后染色体的数目均较多。后期Ⅰ和末期Ⅰ出现落后染色体的频率约为53%。末期Ⅰ还观察到染色体粘黏现象（图2-F、G）。

2.1.3 二分体 在末期Ⅰ染色体移到两级后开始松散变细，逐渐形成2个子核；同时细胞质分为两部分，于是形成2个子细胞，称为二分体。二分体停留时间很短，在末期Ⅰ后仅接着就进入下一次分裂。在二分体时期观察到核外染色体及二分体大小不一样等异常现象（图2-H、I）。

2.1.4 中期Ⅱ 在减数分裂中期Ⅱ，2个刚分离的子细胞并列在一起，二分体的染色体在纺锤丝的牵引下排列在2个子细胞的中央（图1-I）。中期Ⅱ纺锤丝多为“平行纺锤丝”，仅观察到1个细胞形成“八字形纺锤丝”（图3-A），没有观察到“垂直纺锤丝”。中期Ⅱ仍观察到一些散落在赤道板外的染色体（图3-B），出现频率约为56%。

2.1.5 后期Ⅱ 观察到二分体染色体不同时分离的现象，例如其中一个子细胞的染色体已经分离进入后期Ⅱ或末期Ⅱ，而另一个子细胞的染色体还处在细胞的中央，未进行分离（图3-C、D、E）。在后期Ⅱ观察到提前分离的染色体和落后染色体（图3-F、G），但是每个子细胞中落后染色体的数目均较少，后期Ⅱ异常细胞的比例约占73.5%。

2.1.6 末期Ⅱ～四分体 减数分裂的末期Ⅱ，到达两级的染色体已经解螺旋，子细胞中间形成细胞板，新的核膜和核仁形成，形成四分体（图1-J），此时观察到三分体、微核、大小不均等的四分体以及多面体等异常现象（图3-I、J、K、L），其中大小不均等的四分体出现的频率较高，约为46.7%，三分体、微核及多面体均较少，频率未统计。本研究中F1代花粉母细胞减数分裂指数大约为53.3%，表明其具有较大的遗传不稳定性。

2.2 花粉母细胞减数分裂不同步性观察结果

取杂交F1代同一小花的3个花药于同一玻片上进行制片观察其花粉母细胞减数分裂情况，结果有多个分裂时期同时存在于一张制片中，如终变期、中期Ⅰ、后期Ⅰ和中期Ⅱ等，最大跨度为6个分裂时期（图4），说明杂交F1代花粉母细胞减数分裂存在较大的不同步性。

2.3 DAPI染色观察结果

采用DAPI荧光染料对杂交F1代早期花粉粒细胞进行染色观察，以鉴定花粉败育的时期。结果发现大多数小孢子在单核时期就发生皱缩变形（图5-A），说明甘蔗属热带种与蔗茅属滇蔗茅远缘杂交F1代花粉败育的时期为单核小孢子时期及之前的小孢子母细胞时期和四分体时期。

2.4 成熟花粉粒育性观察结果

取父本滇蔗茅（对照）及杂交F1代材料的成熟花粉粒，用1% I2-KI溶液进行染色观察，结果父本滇蔗茅（云南95-19）的花粉量多，花粉粒呈圆形，颜色呈黑色或黑褐色，可育率达90.9%（图6-A）。而所观察的8个杂交F1代植株的花粉量均很少，花粉粒形状不规则、发生皱缩变形，染色效果为淡黄色或基本不染色，花粉无活力，花粉败育率为100%（图6-B）。

3 讨论与结论

减数分裂过程同源染色体是否能够顺利重组对二价体的正确形成和同源染色体的精确分离至关重要。因为重组形成的交叉是同源染色体分别受两极纺锤丝牵引稳定排列在赤道板上所必需的[27]。安洪周等[28]的研究结果表明，光稃野燕麦遗传物质干扰了小麦同源染色体或部分同源染色体的正常配对，造成F3代株系减数分裂异常和遗传不稳定。

在小麦远缘杂交后代减数分裂过程中经常形成后期落后染色体，落后染色体滞留在细胞质进一步形成微核，微核中染色体大多为外源染色体[29-30]。这些外源染色体在杂种胚的发育过程中会逐代消除[31]，其所携带外源有益基因随之消失。小孢子母细胞减数分裂过程是否正常是花粉可育性的关键，刘春等[32]和吴杉等[33]的研究结果表明：减数分裂过程中染色体桥、不等二价体、滞后染色体、微核等异常现象都会造成百合育性低。在作物远缘杂交中，由于F1染色体组来源不同，染色体组间存在不平衡性，减数分裂染色体配对异常，常出现单价体，落后染色体以及微核等现象，因此导致了杂种不育[34]。胡丹艳[35]对（亚洲棉×比克氏棉）F1双二倍体不育系小孢子减数分裂过程进行观察时发现在中期Ⅰ染色体散落在赤道板外、后期Ⅰ多价体的不等分配、配对二价体整体分离、中期Ⅱ染色体不同步分离、落后的染色体丢失或随机分配、异常纺缍体产生多极分离，形成多分孢子，产生微核。这些孢子中染色体数目相差颇大，最终形成畸形、小花粉粒，导致不育。栽培稻与非AA组野生稻杂种不育性的研究结果表明，杂种花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ以单价体为主，无法配对，由此导致杂种几乎完全雄性不育[36-38]。傅雪琳等[39]对广陆矮4号与高秆野生稻种间杂种的花粉育性与胚囊育性及其发育过程做了系统研究，表明栽培稻与非AA组野生稻种间杂种是一个集合了异源染色体的新个体，这必将使不同染色体组来源的染色体在杂种F1减数分裂过程中行为异常，从而产生染色体不育所导致的胚囊败育和花粉败育。目前主要通过以加倍的栽培稻同源四倍体与非AA组野生稻杂交[40]，或对栽野杂种F1染色体加倍，提高杂种雌配子育性，再与栽培稻亲本回交[41]等方法来提高杂种育性。

本研究结果与前人的研究结果较相似，在甘蔗热带种与滇蔗茅远缘杂交F1代花粉母细胞减数分裂过程中，观察到落后染色体、中期Ⅱ染色体不同步分离以及异常四分体等异常现象，充分说明了滇蔗茅染色体导入后影响了甘蔗同源染色体以及部分同源染色体的重组和分离，减数分裂过程产生异常染色体行为和异常细胞分裂是导致杂交F1代植株花粉完全败育的主要原因。本研究为甘蔗属热带种与滇蔗茅远缘杂交F1代花粉败育机制的研究提供了细胞学依据，同时为今后如何更有效地利用滇蔗茅及其杂交后代材料等提供细胞学参考资料。本文采用常规染色体压片法进行显微观察，无法区分甘蔗属热带种染色体和滇蔗茅染色体，所以对于落后染色体的来源，以及滇蔗茅染色体是否与甘蔗属热带种染色体发生交换重组，还需要进一步借助基因组荧光原位杂交技术进行分析鉴定。

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