李文彬等

摘 要 为阐明转录因子在猕猴桃果肉花青素形成过程中的调控作用，采用3′RACE和5′RACE技术从‘红阳猕猴桃果肉中克隆到一个bHLH型转录调控因子AdGL3。实时荧光定量PCR结果表明，AdGL3基因的表达水平与猕猴桃花青素的净积累过程基本一致，即在净积累过程中表达水平比较高，而净积累停止后，该基因的表达水平也相应降低。表明该基因是参与猕猴桃花青素合成的重要调控因子之一。结果为下一步猕猴桃花青素形成机制及调控机理的研究奠定基础。

关键词 猕猴桃；花青素；AdGL3基因；表达水平

中图分类号 S663.4 文献标识码 A

Abstract To investigate the regulation mechanism of transcript factor on anthocyanin biosynthesis in red-fleshed A. Chinensis cv. Hongyang， AdGL3 was cloned from flesh according to the conserved domains through 5′ and 3′ RACE method. The results of quantitative real time PCR indicated that the relative expression level of AdGL3 was consistent with the net accumulation change of anthocyanin that it had high transcript level when the net accumulation of anthocyanin happened and low after the net increase stopped， suggesting that AdGL3 should be one of important transcript factors for anthocyanin biosynthesis. It could be benefit to illustrate the mechanism of anthocyanin biosynthesis and regulation in kiwifruit.

Key words A. Chinensis cv. Hongyang； Anthocyanin； AdGL3； Expression level

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.014

猕猴桃隶属猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia Lindl.），为多年生木质藤本植物，雌雄异株。中国猕猴桃自然资源异常丰富，猕猴桃属物种间和种内存在着高度的遗传变异，尤其是果肉的颜色丰富多彩，有绿色、黄色、红色、橙色、紫色、绿底红心或黄底红心。近年来，中国加快了红肉猕猴桃品种的选育和改良，在国际市场上，富含花青素的特质是红肉猕猴桃倍受消费者青睐的关键特性，未来将占据更大的市场份额。但是，目前市场上唯一的红肉品种‘红阳猕猴桃品种不抗夏季高温干旱，果肉中花青素的含量易受夏季温度和湿度波动的影响[1]。而花青素的含量高低直接影响到‘红阳猕猴桃的经济价值和种植户的经济利益，因此，猕猴桃中花青素合成调控机理对‘红阳猕猴桃花青素积累量的研究非常重要。

目前对植物花青素合成途径的研究已经非常清楚[2-4]，花青素生物合成途径受多种转录因子在不同时空上的组合调控，主要包括MYB、bHLH、亮氨酸拉链、MADS-box、WD40、WIP和WRKY等因子[5]，大部分物种的花青素合成是由MYB、bHLH、WD40这三类转录因子形成的转录复合物MBW来调控[6-7]。近年来，已经从拟南芥[8]、葡萄[9]、大丽菊（Dahlia variabilis）[10]、苹果[11]等植物中克隆了bHLH类转录调控因子基因，并且证明其对花青素合成有正调控作用。bHLH（basic helix-loop-helix， 碱性螺旋-环-螺旋）类转录因子是植物中仅次于MYB的第二大转录因子家族，bHLH类转录因子一方面通过与WD40结合进而对形成调控花青素的复合物MBW非常重要[12]，而且在R2R3-MYB蛋白的稳定性和转录调控作用中发挥重要作用。另一方面bHLH蛋白可以通过提高花青素结构基因中启动子区的活性，进而增加转录因子与结构基因作用的稳定性[13]。如葡萄中调节花青素合成的bHLH基因VvMYC1和VvMYCA1，VvMYC1能与葡萄所有R2R3-MYB蛋白（VvMYB5a/5b、VvMYBA1/A2、VvMYBPA1）相互作用，激活花青素或者原花青素合成结构基因如查耳酮异构酶（CHI）、花青素还原酶（ANR）、类黄酮糖基转移酶（UFGT）的表达[14]。本研究从‘红阳猕猴桃果肉中克隆到一个bHLH类转录调控因子AdGL3基因，对其序列及在‘红阳猕猴桃果实发育过程中的表达水平进行研究，为猕猴桃花青素合成机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用材料为2012年四川蒲江种植的‘红阳猕猴桃（四川中兴农业科技有限公司提供）。分别于坐果后30、60、70、90、100、110、120、140 d采集‘红阳猕猴桃果肉。

每个生育期取3个果实取样后用冰浴保温箱带回实验室，取出果肉中果皮部分（即花青素积累部位），在液氮中速冻，-70 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 ‘红阳猕猴桃果肉花青素的提取及测定

冰冻的果肉在液氮中研磨至粉沫，然后用五倍体积的甲醇/水/乙酸（体积比80 ∶ 20 ∶ 1）提取[15]，以锡箔纸包裹，28 ℃、200 r/min，提取30 min，于4 ℃冰箱中放置24 h，以0.45 μm的滤纸过滤，上层清液50 ℃旋转蒸发浓缩。

高效液相色谱检测花青素含量，以美国Water公司的Alliance2695液相色谱仪进行测定，C18柱（Nova-pak），规格为150 mm×3.9 mm，颗粒度4 μm。流动相A为1%的甲酸，B相为乙腈，流速0.8 mL/min，530 nm下检测。

花青素标准品为cyaniding 3-O-galactoside （Chromadex USA， CAS No. 27661-36-5）和cyaniding 3-O-glucoside（WAKO，Jap，CAS No. 7084-24-4）。

1.2.2 ‘红阳猕猴桃RNA的提取及检测 采用改良的CTAB法提取RNA[16]。

RNA提取后，以1%的琼脂糖凝胶电泳对所提取的RNA进行完整性检测，以Nanodrop2000分光光度计来检测RNA浓度及A260 nm/A280 nm值。

1.2.3 AdGL3基因的克隆、验证及序列分析 根据已报道的拟南芥中bHLH基因保守区设计引物，引物序列为：

5′引物为：5′-TGGGGNGAYGGNTAYTAYAA-3′

3′引物为：5′-AYTCNGTRTCNGCNARRTCYTC-3′

3′RACE和5′RACE参照大连宝生物公司3′ （Takara Code： D314）和5′（Takara Code：D315）RACE试剂盒说明书进行。基因PCR产物纯化回收后连接pEASY载体（北京全式金生物技术有限公司）测序。

进化树分析软件采用MEGA（V 5.02）进行。

1.2.4 AdGL3基因在果实发育过程中的表达水平分析 将3个果实分别提取RNA后，等量混合形成RNA池，再反转录成cDNA，根据AdGL3基因的cDNA序列设计特异性引物进行实时荧光定量PCR试验（RT-PCR），序列特异性引物如下：

5′引物：5′-AAAAGGTTATTGTTGGGGTAATGG

CA-3′

3′引物：5′-ACCGTCTTCCTCGTCTTAATGTCT

C-3′

猕猴桃Actin（GI：149938963）基因为内参基因，其序列特异性引物如下：

5′引物：5′- TGAGAGATTCCGTTGCCCAGAAG

T-3′

3′引物：5′-TTCCTTACTCATGCGGTCTGCGAT-3′

实时荧光定量PCR条件：

1.5 μg总RNA以FastQuant RT kit（with gDNase）（TIANGEN Biotech）（北京）进行反转录合成第一链cDNA。1 μL cDNA模板，10 μL SYBRR Premix ExTaqTM（DRR041A，Takara），0.2 μmol/L正反向引物，RT-PCR在Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR（Applied Biosystem， Foster City， CA， USA）仪上进行，每个基因3个重复，以基因AdActin（GI：149938963）在30DAA处的值作为标准。

扩增程序为95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环； 72 ℃ 20 s，溶解曲线程序为95 ℃ 15 s；95 ℃ 1 min内以0.3 ℃递增，最后95 ℃ 15 s。

2 结果与分析

2.1 ‘红阳猕猴桃果实发育期间花青素变化趋势

‘红阳猕猴桃果实花青素的结果显示，果实中花青素的积累经历了缓慢-快速-下降-再升高的过程（图1）。开花后到花后30 d，果实中没有花青素的积累，花后30～60 d为缓慢积累期，中果皮部位逐渐出现红色丝状分布的花青素，表明花青素开始积累，这段时期花青素的积累较慢。而花后70～90 d为花青素快速积累期，直到花后100 d，花青素净积累持续增加，此时果肉中花青素的浓度达到最高（56.9 μg/g 鲜重）。此后，花青素的含量不稳定净积累量下降（120 d），而在收获前又略有上升（140 d）。

2.2 RNA质量及浓度检测

以1%的琼脂糖凝胶电泳对所提取的RNA进行完整性检测（图2），发现提取的总RNA均呈现2条清晰、无明显拖尾现象的条带，说明获得的总RNA样品完整性较好。其中RNA浓度都比较高，且OD值要求达到：1.8≤A260 nm/A280 nm≤2.2，A260 nm/A230 nm≥1.8，RNA浓度范围为540～1 500 ng/μL。高质量高纯度的RNA为下一步cDNA反转录、基因克隆及实时荧光定量PCR提供保证。

2.3 基因克隆及序列分析

AdGL3基因cDNA全长约2 027 bp（图3）。对其序列进行分析后，结果发现AdGL3基因开放阅读框为1 947 bp，编码一个由649个氨基酸组成的蛋白，利用NCBI在线工具保守区序列分析（Conserved Domain Search Service）软件对其编码的氨基酸序列结构进行分析，证明其具有保守结构域bHLH-MYB_N和HLH（图4）。

利用MEGA（5.0）软件，将AdGL3基因编码的氨基酸序列与已报导的模式植物拟南芥、葡萄等的同源基因的氨基酸序列进行比对，发现与葡萄（Vitis vinifera）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的AdGL3进化关系最近，氨基酸序列相似性最高（图5），表明AdGL3基因在功能上与已经报道的GL3基因对花青素的调控作用相关。

2.4 AdGL3基因在‘红阳果实发育期间的表达模式

实时荧光定量PCR结果表明，果实发育期AdGL3的表达水平经历了较明显的高峰和平缓期，花后60 ～100 d，AdGL3的表达量变化幅度比较大，其中90 d时表达量是70 d时表达量的28倍，这可能与这一阶段中花青素变化速率最大相关（图6）。总体来说，AdGL3的表达水平与花青素净积累的规律基本一致，花后30 d果实花青素开始合成，一直到100 d花青素呈现净合成持续增加，而AdGL3的表达水平也呈现出持续增加趋势，而当花青素在100 d后净积累停止后，AdGL3基因的表达水平也呈现缓慢下降趋势，直到果实成熟。

3 讨论与结论

GLABRA3是拟南芥中最主要的调控毛状体及根毛发育的复合蛋白之一[17]。近年来许多研究表明，GL3通过与MYB及WD40蛋白形成调控复合物MBW来调控花青素合成[6，18-19]。Myb/bHLH/WD40调控复合物主要调控花青素合成途径中的后期合成基因，如二氢黄酮还原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）和类黄酮糖苷转移酶（UFGT）等[20]。本研究克隆得到的AdGL3基因具有与其他物种中调控花青素的bHLH类基因GL3相似的结构，很可能是参与‘红阳猕猴桃中花青素合成的重要转录调控因子之一。

在本研究中，AdGL3基因在‘红阳猕猴桃果肉中花青素净积累增加的过程中保持较高的表达水平，尤其在花青素快速合成期（70～90 d），其表达水平的变化幅度最大。一般来说转录因子的转录表达总是先于受调控基因的表达，从而对被调控基因进行调控，花青素的合成将更加滞后于受调控基因的表达[21]，这可能是AdGL3基因的表达水平与花青素净积累增加的趋势不太一致的主要原因。果实中花青素的合成是一个复杂的调控过程，积累水平受到内部遗传、生长发育和外部环境的影响[6]，基因的转录水平也会受到影响。

花青素含量是果实品质的一个重要方面，因此也是许多遗传育种工作的重点，通过转录因子来调控果实的品质，如花色和果色，是目前一种非常有效的方法。猕猴桃是重要的经济水果之一，尤其是红肉猕猴桃—‘红阳以其果实富含花青素而成为近年来消费者的新宠。本研究中获得的AdGL3基因对‘红阳猕猴桃花青青合成机制研究有重要作用。

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