郜祥雄等

摘 要 锥栗总RNA的提取质量是后期锥栗空棚分子机理研究的关键。以锥栗花序为材料，采用2种植物RNA快速提取试剂盒、改良Trizol法和改良CTAB法提取锥栗总RNA，并采用多种方法检测提取出的总RNA的质量。结果表明：采用改良CTAB法获得的总RNA可明显看到28S和18S条带，且亮度比约为2 ∶ 1，DNA基本无残留，点样孔无杂质，OD260/OD280均接近2，而OD260/OD230均超过2，经逆转录可作为模板，获得LFY基因。改良后CTAB法最合适，所得的总RNA产量高、比较纯净、完整，可用于后续的逆转录并进行基因片段的扩增。

关键词 锥栗；RNA；花序；LFY

中图分类号 S664.2 文献标识码 A

Abstract The quality of extracted total RNA is the key to study the molecular mechanism of chinquapin later. In this study， chinquapin inflorescences were taken as the material. The study used two types of plant RNA Rapid Extraction kit， a modified trizol method and a improved CTAB method to extract the chinquapin total RNA， and used some methods to test the quality of the RNA. The total RNA obtained by improved CTAB method could significantly observe 28S and 18S bands and the brightness ratio was about 2 ∶ 1， DNA hardly leave， spotting holes without impurities， OD260/OD280 were close to 2， while OD260/OD230>2. The RNA can be used as a template after reverse transcription to obtain LFY gene. The improved CTAB method was most appropriate， the total RNA had high yield and relatively pure， complete and could be used for subsequent reverse transcription reaction to clone.

Key words Chinquapin（Castanea henryi）；RNA；Inflorescence；LFY

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.015

锥栗（Castanea henryi Rehd.&Wils.），在福建俗称“榛子”，属山毛榉科栗属植物[1]。锥栗果实含有大量淀粉，属于淀粉植物，其营养价值高于面粉、大米和薯类[2]，是福建北部较为特色产品和天然绿色食品。闽北各县市大量栽培锥栗，还有大量的天然锥栗林的分布[3-6]。总之，丰富的锥栗资源，如能得到充分利用，一定可以为闽北农村地区的经济发展起到重要的作用。

空棚，即栗果成熟后苞壳中不能形成栗子造成空苞的现象，在生产上普遍存在，且对产量影响极大。锥栗空棚的原因主要有3种观点[7-10]：开花期授粉受精不良而引起；品种遗传问题；胚胎发育的营养问题。由于营养不良，尤其是缺硼，树体营养满足不了坚果生长发育所需的养分，因此发生部分胚发育不全或停止发育而形成空苞。同时，在生产中发现锥栗雄花的开花数量极大，而雌花的开花量则很小，雌雄花序比为1：（12～15），雌雄花比为1：（2 000～4 000）[11]，这在板栗上也有类似的状况[12]，大量的雄花，需要消耗大量的树体营养，对锥栗胚胎发育和果实膨大的营养供给造成很大的障碍。开展锥栗空棚分子机理的研究，对找出并解决锥栗空棚问题尤为重要。

目前，锥栗的研究主要集中于栽培[13-15]，病虫害防治[16-18]及采后锥栗果实的保存加工[19-21]等方面，而分子生物学方面主要是锥栗的RAPD[22]和ISSR[23-24]分析以及蛋白质[25-27]等研究，未对锥栗空棚的分子机理展开研究。因此，本研究以锥栗花序为材料，提取得到高质量的总RNA，为开展锥栗空棚分子机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为锥栗的花序，品种为乌壳长芒，4月份在建瓯采集已抽生花序的结果枝，放入冰盒中带回福州，进行液氮处理，放入-40 ℃冰箱中保存。

CTAB提取液：1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），20 mmol/L EDTA（pH=8.0），2% CTAB，2%PVP-40，β-巯基乙醇（用前每1 mL提取液加入20 μL）；SuperscriptTMⅢ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR试剂盒（Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 锥栗花序总RNA的提取 采用改良CTAB法[28-31]，具体方法：

取2个1.5 mL的离心管，加入1 mL的CTAB提取液，放入65 ℃水浴锅中预热30 min。称取0.2 g锥栗样品，灼烧，并用液氮冷却，迅速研磨，并分装至预热好的离心管中，每管加20 μL β-巯基乙醇，涡旋4 min，放入65 ℃水浴20 min，颠倒混匀3次。

在离心管加入300 μL氯仿，振荡，12 000 r/min 4 ℃离心10 min；取上清液（700 μL）到新离心管中，并加入等体积的氯仿，振荡，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液（450 μL）到新离心管中，加入等体积的8 mol/L LiCl，轻轻摇匀，放入4 ℃冰箱沉淀3～4 h。

沉淀后，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，移除上清，加入800 μL 75%乙醇洗涤，振荡，12 000 r/min 4 ℃离心3 min，用200 μL以下的移液枪移除乙醇，微离心之后，再用10 μL移液枪移除多余的乙醇，放在超净工作台内慢风10 min。

加入30 μL ddH2O溶解，若总RNA得率低，可稍加水溶解。

Trizol法，EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）和柱式植物RNAout Column Plant RNAout（北京天恩泽基因科技有限公司天净沙系列）提取RNA具体方法详见陈桂信等[32]研究方法和试剂盒使用说明书。

1.2.2 LFY基因片段的克隆 验证所获得的RNA质量，采用Invitrogen公司的SuperscriptTMⅢ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR试剂盒进行逆转录，并以此产物进行RT-PCR。

利用板栗LFY基因（DQ270548.1）设计RT-PCR上下游引物，分别如下：

LFY61上 5′-AAGCTAGCTTCATTGATGGATC-3′

Tm值：53.9 ℃

LFY908下5′-GCCTTCTTCGCAAACCTAA-3′ Tm值：53.0 ℃

LFY1171下 5′-CATGACAAAGTTGCCGAAGTT-3′

Tm值：53.7 ℃

上述引物由上海博尚生物技术有限公司合成。

RT-PCR具体反应体系：0.5 μL逆转录的产物、上下游引物各1 μL、10 mmol/L dNTPmix 0.5 μL、10×Ex-Taq buffer 2.5 μL、Ex-Taq（5 U/μL） 0.2 μL，用ddH2O补足至25 μL。梯度PCR程序为：94 ℃，5 min→94 ℃，40 s→49.5 ℃，50 ℃，51.5 ℃和52 ℃共4个梯度，40 s→72 ℃，40 s（回到第2步，再进行34个循环）→复性72 ℃，10 min→4 ℃，0 s。

取PCR产物10 μL进行1.5%琼脂糖胶检测，根据引物设计的上下游大小，估计目的条带大小，在紫外光下将目的条带切下。将回收纯化、载体连接转化后获得的菌液进行测序。

2 结果与分析

2.1 锥栗花序总RNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光检测

应用Trizol法和EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取，经1%琼脂糖凝胶检测，泳道上均不能看到任何条带，说明未能获得RNA，而采用柱式植物RNAout试剂盒和改良CTAB法提取可获得锥栗总RNA。由图1可知，A泳道28S和18S条带均较亮，且28S的亮度差不多为18S亮度的2倍，但此方法DNA去除效果较差，DNA残留较多，点样孔杂质残留较多；B泳道可明显看到28S和18S条带，且亮度比约为2 ∶ 1，而DNA残留基本没有，点样孔无杂质。

纯RNA溶液的OD260/OD280比值应介于1.8～2.0之间，如果小于这个值，则说明有蛋白质的污染或是RNA发生降解，OD260/OD230比值应大于2.0，如果远小于这个值，则表明其中有大量的小分子或盐存在。RNA浓度（μg/μL）=OD260×200×40/1 000。由表1可知，改良CTAB法OD260/OD280为1.97，OD260/OD230为2.10，改良后的CTAB法提取的总RNA基本全部满足要求。

2.2 LFY基因片段的克隆

由图2可知，使用“LFY61上”作为上游引物，下游引物选择“LFY908下”时，目的片段847 bp，第2，3泳道均为该下游引物扩增出来的条带，第2泳道退火温度为49.5 ℃，第3泳道为51.5 ℃，在接近850 bp的位置，以上泳道均出现目的条带，但第3泳道亮度明显比第2泳道高，以第3泳道的条带回收；下游引物选择“LFY1171下”时，目的片段1 110 bp，4，5泳道均为该下游引物扩增出来的条带，第4泳道退火温度为50 ℃，第5泳道为52 ℃，在接近1 110 bp的位置，以上泳道均出现目的条带，但第5泳道亮度明显比第4泳道高，以第5泳道的条带回收。

经测序得848 bp和1 111 bp的片段，在NCBI进行核苷酸比对，与板栗等LFY基因同源性高，说明所提取的RNA能够应用于基因克隆。1 111 bp序列在NCBI进行序列的blastn（图3），与其他植物同源性71%～99%，与板栗LFY基因的同源性最高，达99%，可以确定此序列为锥栗花序LFY同源基因片段，证明改良CTAB法提取的RNA进行逆转录得到模板cDNA的纯度高，满足后续PCR的要求。

3 讨论与结论

Northern杂交分析、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增（RACE）、差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）、cDNA-AFLP和同源克隆等[33-34]研究时均需要提取RNA，成功提取高质量总RNA是进行分子生物学研究的基础。无降解的mRNA才能真实地反映出细胞内的基因表达情况，因此需要提取高纯度和无基因组DNA的锥栗花序总RNA，为后续的锥栗空棚分子机理研究做准备。

在植物RNA的提取过程中，植物细胞破碎后细胞内源RNase会降解mRNA，多酚类物质和多糖也从细胞中释放，影响RNA的提取。植物内源RNase污染首先要通过选用适当的RNA提取方法，尽量缩短提取时间来解决，还可加入适量的RNase抑制剂来有效抑制RNase的活性，且尽量在低温下完成所有操作[34-35]。多酚类物质的氧化产物与RNA的结合是不可逆的，产生褐化效应，导致RNA降解和丧失活性[36]，去除酚类化合物在提取的初始阶段防止其被氧化，可通过还原剂法、螯合剂法、Tris-硼酸法、牛血清白蛋白（BSA）法，丙酮法等[37-38]将其与RNA分开。RNA样品中残留的多糖会抑制逆转录酶的活性，且多糖能与RNA共沉淀形成难溶胶状物，多糖的许多理化性质与RNA很相似，在多糖去除的同时，RNA得率也会降低[39]。王玉成等[38]总结去除多糖的方法有：材料为幼嫩部位或将植物进行水培等；采用直接钩出多糖法、CTAB沉淀法、LiCl法、2-甲氧基乙醇抽提法、溴化乙锭抽提法和KAc法等方法去除多糖。

近几年，RNA提取试剂盒的使用，提高了植物RNA提取速度，且操作简便，耗时较少，是实验室人员的常选方案，但其价格偏贵。随着中国一些生物技术公司的兴起，国产的一些RNA提取试剂盒较便宜，但其对材料的要求较高，适用性和提取质量上还有很大的不足。Trizol法在很多的实验室中普遍应用，具有用量少，操作简易，提取效果好等优点。因此，本试验首先用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司），但一直都没提出RNA，后改用Trizol法，为提高Trizol法去除多酚的能力，加入PVPP（研磨材料时加入）和β-巯基乙醇，均未能提出RNA，而柱式植物RNAout Column Plant RNAout（北京天恩泽基因科技有限公司天净沙系列）试剂盒提取时，获得较好的RNA条带，但是DNA残余量较大，采用改良后的CTAB法，得到较理想的RNA条带。该CTAB法经多次重复试验，包括减少锥栗花序的用量至每管0.05 g，减少LiCl沉淀时间至3 h均能稳定提出高质量的RNA。该方法使用较高浓度的CTAB不仅能对植物细胞有较好的裂解作用，而且还能有效地分离核蛋白与核酸的复合物，同时和β-巯基乙醇、PVP共同作用，可以更为有效地变性蛋白和抑制RNase的活性，本试验的CTAB提取液加入1.4 mol/L NaCl，而较高浓度的NaCl，是去除多糖污染的有效手段，因此更有效地将样品中的多糖去除。

本试验吸收前人研究经验，通过综合及改良，形成锥栗RNA提取的适合方法，提高锥栗总RNA的提取质量，是后期锥栗空棚分子机理研究的关键，为后续试验打下良好基础。

参考文献

[1] 张玉星. 果树栽培学各论（北方本）[M]. 北京： 中国农业出版社， 2003： 262.

[2] 冯金玲， 杨志坚， 陈 辉. 锥栗的研究进展[J]. 亚热带农业研究， 2009， 5（4）： 237-241.

[3] 郑诚乐， 江 由. 闽北锥栗品种资源及其利用前景[J]. 福建农业大学学报， 1998， 27（3）： 291-295.

[4] 夏瑞满， 吴东平， 吴云峰， 等.我国锥栗主产区发展现状与对策[J]. 中南林业调查规划， 2008， 27（3）： 59-61.

[5] 孙郑英， 范渠森. 政和县锥栗产业现状及可持续发展对策[J].柑桔与亚热带果树信息， 2005， 21（4）： 16.

[6] 陈秀琴. 闽北主要锥栗品种及其栽培管理技术[J]. 福建农业科技， 2007（6）： 22-24.

[7] 范淑珠， 潘香玉. 锥栗空棚症的发生与防治[J]. 上海农业科技， 2005（2）： 103.

[8] 郑诚乐， 黄雪羚， 江 由. 板栗空棚问题的研究进展[J]. 福建果树， 1995（2）： 22-24.

[9] 张宇和. 栗树研究综述[J]. 园艺学报， 1963， 2（2）： 133-148.

[10] 郑诚乐.锥栗若干生物学问题研究[D].福州：福建农林大学，2008.

[11] 郑诚乐. 锥栗板栗无公害栽培[M]. 福建科学技术出版社， 2008： 121.

[12] 郭成圆， 魏安智， 吕平会， 等.板栗雏梢分化期内源激素的动态变化特征[J]. 西北植物学报， 2010， 30（10）： 2 06l-2 066.

[13] 吴盛清. 促进锥栗优质高产高效修剪技术的探讨[J]. 内蒙古农业科技， 2006（7）： 132-133.

[14] 蒋福勇. 大果锥栗简要栽培技术[J]. 广西园艺， 2008， 19（3）：57-58.

[15] 张世珍. 低产锥栗高产优质栽培技巧[J]. 福建农业， 2010（1）：16-17.

[16] 黄宗安. 锥栗疫病的抗病机制与抗病品种选育研究进展[J]. 林业勘察设计， 2008（2）： 73-76.

[17] 刘章华， 吴连海， 赖俊声， 等.锥栗毁灭性蛀干害虫小蠹虫的防治[J]. 现代农业科技， 2009（13）： 158-159.

[18] 黄红青. 锥栗对栗瘿蜂抗性与营养元素关系研究[J]. 福建林业科技， 2005， 32（4）： 60-63.

[19] 鲍世利， 陈锦权， 吴仲弈. 锥栗贮藏保鲜研究[J]. 广州食品工业科技， 2003， 19（2）： 18-21.

[20] 谢芬华， 周 峰. 锥栗科学贮运方法[J]. 福建农业， 2005（10）： 24-25.

[21] 陈 钦， 邹双全. 锥栗干制研究Ⅱ-锥栗烘干工艺的研究[J]. 经济林研究， 2002， 20（3）： 39-41.

[22] 俞晓曲. 锥栗胚胎发育与遗传多样性研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2006.

[23] 郑诚乐， 钟凤林， 潘东明，等. 锥栗果实双向电泳体系的建立[J]. 福建农林大学学报（自然科学版）， 2010， 39（5）： 475-479.

[24] 郑诚乐， 刘小芝， 钟凤林， 等.锥栗叶片两种提取蛋白方法的比较[J]. 中国园艺文摘， 2010（3）： 5-7.

[25] 刘小芝. 硼处理对锥栗叶片及胚中差异蛋白的影响[D]. 福州：福建农林大学， 2010.

[26] 刘国彬. 锥栗自然居群及农家品种遗传多样性的ISSR分析[D]. 武汉： 华中农业大学， 2009.

[27] 刘国彬，罗正荣，龚榜初. 锥栗不同组织基因组DNA的提取及ISSR-PCR验证[J]. 浙江农业学报， 2010， 22（4）： 420-423.

[28] 赵巍巍， 宗成文， 曹后男， 等. 葡萄花序总RNA提取方法研究[J]. 安徽农业科学， 2007， 37（32）： 16 161-16 162， 16 176.

[29] 何庆元， 吴 萍， 李正鹏， 等. 苜蓿总RNA提取方法比较研究[J]. 中国草地学报， 2009， 31（1）： 116-120.

[30] 李晓毓， 赵德刚， 李丰伯. 一种适用于木本植物RNA提取的方法[J]. 安徽农学通报， 2007， 13（23）： 42， 56.

[31] 许 锋， 蔡 荣， 陈柳吉， 等.核桃不同组织高质量总RNA的提取方法[J]. 果树学报， 2008， 25（3）： 435-439.

[32] 陈桂信， 吕柳新， 赖钟雄， 等. 嫩芽总RNA的提取与纯化[J].江西农业大学学报， 2004， 26（3）： 324-328.

[33] 林 玲， 杨燕凌， 何海福， 等. 总RNA提取方法的比较与分析[J]. 武夷科学， 2009（25）： 97-100.

[34] 杨占军， 谷守琴， 张 健. 几种植物组织总RNA提取方法的特点及疑难对策[J]. 安徽农业科学， 2009， 37（18）： 8 341-8 342.

[35] 郭长奎， 罗淑萍， 李 疆， 等. 新疆巴旦木花药总RNA的提取[J]. 新疆农业科学， 2010， 47（5）： 898-901.

[36] 赵宝勰， 程李香， 林必博， 等.两种马铃薯块茎总RNA提取方法的比较[J]. 广东农业科学， 2010（1）： 124-127.

[37] 李 宏， 王新力. 植物组织RNA提取的难点及对策[J]. 生物技术通报， 1999， 1（5）： 1-6.

[38] 王玉成， 杨传平， 姜 静.木本植物组织总RNA提取的要点与原理[J]. 东北林业大学学报， 2002， 30（2）： 1-4.

[39] Manning K. Isolation of nucleic acids from plants by differential solvent precipitation[J]. Analytical Biochemistry，1991， 195（1）： 45-50.