刘召亮等

摘 要 为研究芒果MiRab11蛋白的互作及其它生物学功能，本文在MiRab11基因序列基础上，采用重叠PCR定点突变技术，获得了2个结构域突变体Mi-Rab11CA和Mi-Rab11DN，将其构建原核表达载体，并成功转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE结果显示，在28 ℃条件下，用0.5 mmol/L IPTG诱导4 h，可获得大量可溶性蛋白的表达。将可溶性蛋白经Ni-NTA argrose层析柱纯化并western blot鉴定，该重组蛋白均可与抗His单克隆抗体发生特异性免疫反应。本研究为深入研究芒果pET-Rab11蛋白生理活性、特异性结合位点及功能调控打下良好基础。

关键词 芒果；MiRab11；突变体蛋白；原核表达；纯化；鉴定

中图分类号 S667.7 文献标识码 A

Abstract In order to study the interaction of MiRab11 with proteins and other biological functions overlapping PCR was applied to obtain two mutant（MiRab11CA and MiRab11DN）based on the known sequence of MiRab11. And the prokaryotic expression vectors of pET-Rab11， pET-Rab11CA， and pET-Rab11DN were successfully constructed and transformed into E.coli BL 21（DE3）. SDS-PAGE results showed that the fusion protein were expressed induced by 0.5 mmol/L IPTG， at 28 ℃ for 4 hours in E.coli BL21. And these soluble proteins could be purified by chromatography on nickel agarose column. Western blotting demonstrated that the recombinant fusion proteins can be recognized by anti-6-His monoclonal antibody. These results provide the basis for the studies of the physiological activity and the specific binding site and the function regulation of the MiRab11 protein.

Key words Mango； MiRab11 gene； Mutant proteins； Prokaryotic expression； Protein purification； Identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.012

Rab家族是Ras蛋白超家族中最大最复杂的小G蛋白成员，普遍存在于真核细胞，定位于细胞内与胞吞和胞吐相关的不同的膜区室上，起分子开关作用，调节囊泡的形成、转运、粘附和融合过程[1-2]，广泛调控植物的生长发育、形态建成、逆境胁迫反应等[3]；转AtRab7基因拟南芥可明显提高对盐的耐受性[4]；AvrPto因子可以与Rab蛋白发生互作，破坏番茄RabE蛋白调节的膜运输途径，使植物感病[5]。Rab11是Rab家族成员中数量最多、功能最多样化的亚家族[6-7]。拟南芥基因组中有57个Rab，其中26个为rab11亚家族成员；葡萄基因组中存在26个Rab，其中rab11为14个[8-9]。芒果MiRabX基因特异性表达于成熟果实中，以此序列为探针，获得番茄SlRab11，反义番茄不能正常成熟[10-11]。烟草NtRab11基因与花粉管的极性生长密切相关[12]。转水稻OsRab11基因拟南芥及其突变体对盐的耐受性明显提高[13]。百脉根基因组中存在10个LcRab11基因，其中4个与根瘤的形成有关[14]。

在前期对芒果进行逆境相关基因差异显示分析中[15]，从芒果逆境胁迫组织中分离获得了一个Rab蛋白家族成员MiRab11，该基因可能与果实成熟，环境胁迫和信号转导相关。为进一步分析其基因蛋白功能，本文采用定点突变技术与原核表达，构建、表达和纯化了MiRab11的原核表达蛋白及其结构域突变蛋白，并经Western Blot证实，上述重组蛋白均可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应。为深入研究芒果MiRab11基因蛋白生理活性、特异性结合位点及功能调控打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体 大肠杆菌DH5α和宿主菌BL21（DE3）细胞购于北京全式金生物公司；原核表达载体pET-30a由广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室王凛馈赠。pMD-18T载体购自TaKaRa。

1.1.2 试剂 限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ、Taq DNA聚合酶、dNTPs等都购自于Fermentas公司（加拿大）；M-MLV逆转录、RNase H、pMD-18T载体、Ligation Kit Ver.2.1均购自TaKaRa；蛋白预染marker、氨节青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、IPTG购于上海生工；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Bioer公司；Ni金属螯合柱和试剂均购自Qiagen 公司；鼠源His标签抗体、山羊抗鼠IgG购自TIANGEN 公司（北京）；其它试剂均为国产分析纯试剂。引物合成及序列测定由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 MiRab11基因CDS的克隆 根据已克隆的MiRab11基因全长cDNA序列（GenBank登录号为KF768564），设计包含酶切位点的上游和下游引物与定点突变引物（表1）。以芒果果实cDNA为模板，通过高保真Dream Taq聚合酶PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，连接到pMD-18T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，经蓝白斑筛选和菌液PCR检测阳性后，进行测序。

1.2.2 MiRab11基因结构域定点突变体片段的扩增

基因突变体片段扩增，参照Ho等[16]重叠PCR定点突变技术。用包含MiRab11基因的大肠杆菌菌株质粒作为模板，以MCF引物与Erab11R引物和MCR引物与Erab11F引物，分别进行第一轮PCR，将产物分别稀释100倍后，各取1 μL作为第二轮PCR的模板，以Erab11F和Erab11R引物进行第二轮PCR，即可得到Erab11的突变片段MiRab11CA（Q72L）。同理，可得到Erab11的突变片段MiRab11DN（S27N）。

1.2.3 重组表达载体的构建 以测序正确的重组pMD18-T-Rab11、pMD18-T-Rab11CA和pMD18-T-Rab11DN菌株提取质粒，用BamHⅠ与 SalⅠ分别双酶切表达载体pET-30a（+）和上述提取的质粒，回收线性载体片段和目的基因片段，用SolutionⅠ连接后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。菌液PCR和测序检测正确后，提取质粒。经BamHⅠ与 SalⅠ双酶切验证无误后，将质粒转化原核表达菌株BL21，筛选阳性菌株，用于重组蛋白表达。

1.2.4 基因原核表达分析 将上述重组表达质粒和空载体pET-30a（+）分别转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单菌落接种于终浓度为50 mg/mL Kan的LB培养基（20 mL）中，37 ℃ 培养过夜，以1 ∶ 50的比例加入含Kan的LB培养基中，37 ℃培养至OD600约为0.8时，用终浓度为0.5 mmol/L诱导剂IPTG 28 ℃诱导4 h。收集2 mL菌液，12 000 r/min ，离心5 min，用80 μL PBS（pH7.4）悬浮，加入5×SDS-Loading Buffer 20 μL，混匀后置冰上10 min，煮沸10 min，12 000 r/min，离10 min，取10 μL上清进行15% SDS-PAGE电泳分析诱导蛋白表达情况，以pET30a（+）空载体转化菌样品、BL21菌样品和未经诱导的转化菌为对照。

1.2.5 重组蛋白的纯化与Western Blot检测 将上述重组阳性菌株pET-Rab11、pET-Rab11CA和pET-Rab11DN按同样的条件诱导蛋白表达后，收集菌体，重悬于含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，超声破碎至菌液澄清，离心收集上清。将收集的上清过Ni-NTA小柱，得到纯化的重组蛋白。经SDS-PAGE电泳，电转至硝酸纤维素膜上，封闭液室温封闭90 min后4 ℃过夜；加入1 ∶ 5 000稀释的鼠抗6×His的单抗，室温反应2 h；TBS洗涤后，加入1 ∶ 5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体室温反应1.5 h；充分洗涤，加入新鲜配制的二氨基联苯胺（DAB）显色液；待显色条带清晰后立即用蒸馏水洗涤硝酸纤维素膜。同时设BL21菌和pET30a（+）空载体转化菌样品对照。

2 结果与分析

2.1 MiRab11基因CDS片段及结构域突变体的扩增

MiRab11基因编码的蛋白具有Rab家族保守的G1-G5结构域，其中G1（GDSGVGKS）和G3（DTAGQE）结构域，与GTP的结合有关。通过定点突变结构域中的特定氨基酸，可以突变产生激活态和失活态的Rab蛋白。通过定点突变重叠PCR技术可获得包含酶切位点的MiRab11基因CDS片段及结构域突变体。经琼脂糖凝胶电泳分析，突变体MiRab11CA和MiRab11DN的第一轮PCR产物电泳（图1-a），经过两轮PCR后，得到结构域突变MiRab11CA和MiRab11DN。结果显示两突变体与未突变的MiRab11基因CDS片段大小相等，均约为660 bp，与预期结果相符（图1-b）。

2.2 原核表达载体的构建

提取原核重组的阳性表达菌株pET-Rab11、pET-Rab11CA和pET-Rab11DN质粒，用BamHⅠ与SalⅠ分别双酶切，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，上述质粒均可得与预期结果相符的目的片段，大小约为660 bp（图2）。结果表明，原核重组表达质粒构建成功。

2.3 原核表达载体的表达

重组表达载体转化大肠杆菌，经37 ℃培养至OD600约为0.8时，用终浓度为0.5 mmol/L诱导剂IPTG 28 ℃，180 r/min，诱导4 h后，取样进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示，重组质粒在大肠杆菌BL 21中得到表达，表达的重组蛋白为融合蛋白，分子量约为25 ku（图3），与理论值大小相符。

2.4 重组蛋白纯化与蛋白印迹分析

纯化的重组蛋白pET-Rab11、pET-Rab11DN、pET-Rab11CA与小鼠6×His的单克隆抗体进行Western Blot分析。结果显示，上述重组蛋白在约25 ku处均出现特异性条带（图4），而空白BL 21和pET30a-BL21总蛋白在同一处没有出现特异性条带。

3 讨论与结论

结合原核蛋白表达和定点突变技术是研究蛋白功能的有效方法，通过对Rab蛋白的功能结构域的突变能有效推断蛋白结构域的功能。根据Rab家族成员具有的保守结构域，分别突变与GTP结合有关典型结构域的G1（GDSGVGKS）和G3（DTAGQE），定点突变这些结构域的特定氨基酸，可以产生失活和激活状态下的Rab蛋白突变体，如烟草突变体Rab11b（S28N）和Rab11b（Q73L）均不同程度地影响花粉管的生长；番茄突变体LeRab11a表达可以负调控细胞的分泌活动[17-18]。为研究MiRab11的功能，对该基因及突变体原核表达分析，pET-Rab11及突变体pET-Rab11DN和pET-Rab11CA，经诱导均可获得特异性表达。一般而言，异源真核基因在大肠杆菌中容易受密码子偏好表达影响[15]。本实验结果表明，pET-Rab11及其结构域突变蛋白不受密码子偏好性问题的影响，能够在大肠杆菌中大量特异性表达。一方面，由于Rab11蛋白保守的结构决定了其理化性质，蛋白编码区内不存在信号肽，有跨膜结构[16]，如条斑紫菜Rab11基因构建原核pET-28a表达重组载体可以在大肠杆菌BL 21中成功表达该蛋白[17]；另一方面，使用的高效表达载体pET-30a具有功能强大的 T7 启动子，可以使大多数的细胞资源在诱导充分条件下，被用于目的基因的表达，可获得高效表达的重组蛋白[18]。此外，pET-30a载体含有的6×His标签作为纯化的标识，其His融合蛋白经过Ni-NTA argrose层析柱容易纯化。纯化的蛋白经Western Blot表明，均可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应。

总之，由于直接从芒果树体内分离纯化MiRab11蛋白，难度大，获取量少，不能满足制备MiRab11蛋白多克隆抗体等实验的需要。本研究通过重叠PCR定点突变技术对MiRab11蛋白的功能结构域进行突变，结合原核表达分析获得了大量纯化的MiRab11蛋白及突变蛋白MiRab11DN和MiRabCA，为深入研究芒果MiRab11蛋白生理活性，特异性结合位点及功能调控打下了良好基础。

参考文献

[1] Corbett K D， Alber T. The many faces of Ras： recognition of small GTP-binding proteins[J]. Trends Biochem Sci， 2001， 26（12）： 710-716.

[2] Noviek P， Zerial M. The diversity of Rab Proteins in vesicle transport[J]. Curr Opin Cell Biol， 1997， 9： 496-504.

[3] Sano H， Ohashi Y. Involvement of small GTP-binding proteins in defense signal-transduction pathways of higher plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1995， 92（10）： 4 138-4 144.

[4] Mazel A， Leshem Y， Tiwari B S， et al. Induction of salt and osmotic stress tolerance by overexpression of an intracellular vesicle trafficking protein AtRab7（AtRabG3e）[J]. Plant physiology， 2004， 134（1）： 118-128.

[5] Bogdanove A J， Martin G B. AvrPto-dependent Pto-interacting proteins and AvrPto-interacting proteins in tomato[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97（16）： 8 836-8 840.

[6] Schwartz S L， Cao C， Pylypenko O， et al. Rab GTPases at a glance[J]. J Cell Sci， 2007（120）： 3 905-3 910.

[7] Zerial M， McBride H. Rab proteins as membrane organizers[J]. Natl Rev Mol Cell Biol， 2001（2）： 107-117.

[8] Vernoud V， Horton A C， Yang Z， et al. Analysis of the small GTPase gene superfamily of Arabidopsis[J]. Plant physiology， 2003， 131（3）： 1 191-1 208.

[9] Abbal P， Pradal M， Muniz L， et al. Molecular characterization and expression analysis of the Rab GTPase family in Vitis vinifera reveal the specific expression of a VvRabA protein[J]. J Exp Bot， 2008， 59： 2 403-2 416.

[10] bin Zainal Z， Tucker G A， Lycett G W. A rab11-like gene is developmentally regulated in ripening mango（Mangifera indica L.）fruit[J]. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Molecular Cell Research， 1996， 1314（3）： 187-190.

[11] Lu C， Zainal Z， Tucker G A， et al. Developmental abnormalities and reduced fruit softening in tomato plants expressing an antisense Rab11 GTPase gene[J]. The Plant Cell Online， 2001， 13（8）： 1 819-1 833.

[12] Agarwal P K， Agarwal P， Jain P， et al. Constitutive overexpression of a stress-inducible small GTP-binding protein PgRab7 from Pennisetum glaucum enhances abiotic stress tolerance in transgenic tobacco[J]. Plant cell reports， 2008， 27（1）： 105-115.

[13] Son Y S， Im C H， Kim D W， et al. OsRab11 and OsGAP1 are essential for the vesicle trafficking of the vacuolar H+ - ATPase OsVHA-al under high salinity conditions[J]. Plant Science， 2012， 198： 58-71.

[14] Borg S， Brandstrup B， Jensen TJ， et al. Identification of new protein species among 33 different small GTP-binding proteins encoded by cDNAs from Lotus japonicus and expression of corresponding mRNAs in developing root nodules[J]. Plant J， 1997， 11： 237-250.

[15] Luo C， He X H， Chen H， et al. Genetic relationship and diversity of Mangifera indica L.： revealed through SCoT analysis[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2012， 59（7）： 1 505-1 515.

[16] Ho S N， Hunt H D， Horton R M， et al. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction[J]. Gene， 1989， 77（1）： 51-59.

[17] de Graaf B H J， Cheung A Y， Andreyeva T， et al. Rab11 GTPase-regulated membrane trafficking is crucial for tip-focused pollen tube growth in tobacco[J]. The Plant Cell， 2005， 17（9）： 2 564-2 579.

[18] Rehman R U， Stigliano E， Lycett G W， et al. Tomato Rab11a characterization evidenced a difference between SYP121-dependent and SYP122-dependent exocytosis[J]. Plant and cell physiology， 2008， 49（5）： 751-766.

[19] Del Tito B J， Ward J M， Hodgson J， et al. Effects of a minor isoleucyl tRNA on heterologous protein translation in Escherichia coli[J]. Biol Technology， 1995， 3： 923-929.

[20] 李江姣， 聂 宇， 党旭红， 等. Rab11的结构特征， 效应因子与功能[J]. 细胞生物学杂志， 2008， 30： 681-687.

[21] 王 斌， 郭宝太， 牛孟华， 等. 条斑紫菜Rab11基因的克隆， 序列分析及原核表达[J]. 青岛农业大学学报（自然科学版）， 2012， 29（3）： 201-207.

[22] Davanloo P， Rosenberg A H， Dunn J J， et al. Cloning and expression of the gene for bacterio a Phage T7 RNA polymerase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA， 1984， 81： 2 035-2 039.