王树昌等

摘 要 采用RT-PCR技术，从木薯SC124 cDNA中克隆得到一个具有完整阅读框的基因，命名为MeHDS2，该基因全长2 529 bp，编码842个氨基酸。蛋白质保守结构域分析结果表明，MeHDS2蛋白含有保守的1个HD结构域、1个b-zip结构域、1个START结构域和1个MEKHLA结构域；蛋白质空间结构预测显示其具有3个典型的α螺旋结构；亚细胞定位结果表明，MeHDS2蛋白在植物细胞核中特异表达，因此，推测其为HD-ZIP转录因子家族中的一员。基因表达分析结果表明，MeHDS2基因在木薯根、茎、叶中都有表达，但表达丰度不同。木薯干旱处理14 d后，自形态学顶端往下数第三、四片叶片的MeHDS2表达量显著高于根、茎及其他位置叶片组织。本研究为木薯抗旱分子育种提供了理论基础。

关键词 木薯；HD结构域；START结构域；表达载体

中图分类号 S533 文献标识码 A

Abstract Using RT-PCR technology，one gene sequence named MeHDS2 with 2 529 bp complete opening reading frame（ORF）was obtained from SC124， encoding a protein with 842 amino acids. MeHDS2 had a typical HD-domain，b-zip domain，START domain and a MEKHLA domain. Secondary structure of protein prediction showed that MeHDS2 had three typical α-spiral structures. Subcellular localization results showed that MeHDS2 was specifically expressed in nucleus of plant cells and it should be one member of the HD-Zip family. Gene expression analysis results showed that MeHDS2 was expressed differently in the testing samples，it was predominantly expressed in the 3rd～4th leaves after 14 days of drought treatment. We further speculated that MeHDS2 might have the function as a transcription factor to affect the development of cassava plants. The research provides a theoretical basis for drought resistance molecular breeding.

Key words Cassava；HD-domain；START domain；Expression vector

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.011

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科植物，原产于南美洲亚马逊河盆地，为一年生木本灌木，是世界上第五大粮食作物，同时也是非洲部分国家人们生存的主要食物来源[1]。木薯最大的优点是不与其他粮食作物争地，在其他作物无法生长的干旱地区，木薯却可以很好的生长，其必然存在一定的有效的耐/抗旱机制，值得深入研究。

抗旱相关基因的表达需经历逆境信号的接受、转导、诱导基因的转录以及功能基因的转录后几个不同水平的调节。在逆境条件下，逆境相关的转录因子能与顺式作用元件结合，从而调节功能基因的表达和信号转导，这些转录因子在转基因植物中的过量表达会激活许多抗逆功能基因的表达。HD-ZIP家族是一类植物界独有的转录因子，包含单一的homeodomain（HD）[2]与一个由亮氨酸拉链形成的二聚体结构（b-zip）[3]。拟南芥中HD-ZIP家族有48个成员[3-4]，广泛参与植物器官组织的发育过程、激素作用途径以及对环境条件的反应过程[5]。根据HD-ZIP家族成员结构域的保守性、基因结构及独特的生理功能，HD-ZIP可分为4个亚家族。已有的研究发现，受环境因子（干旱、极限温度、渗透胁迫、光照条件）调控的主要是HD-ZipⅠ或Ⅱ亚家族成员基因；在应对环境条件变化的非生物胁迫时，它们是作为转录因子参与调控植物发育过程[6-8]。其他亚家族成员中，HD-ZipⅢ可能对植物细胞的分化起调控作用[9-10]；HD-Zip IV亚家族成员则可能调控植物表皮细胞的分化[11]。

为研究HD-Zip家族基因在木薯耐干旱生理过程中所发挥的作用，本研究根据木薯干旱转录组测序结果（相关内容还未发表）与木薯基因组数据的比对分析，采用RT-PCR技术，从木薯SC124中克隆得到具有完整阅读框的基因序列，同时对该基因结构、表达谱及其蛋白亚细胞定位进行了分析，旨在为进一步研究木薯抗旱机理奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试木薯品种为“华南124”（SC124），由中国热带农业科学院木薯种质资源圃提供；烟草（Nicotiana tabacum L.）由本实验室保存种植。

1.1.2 菌株与载体 大肠杆菌（Escherichia coli）为DH5α；根癌农杆菌为（Agrobactrium tumefaciens）LBA4404；克隆载体pMD18-T购自TAKARA（大连宝生物），pCAMBIA1300：GFP由本试验室改造保存。

1.1.3 酶与化学试剂 限制性内切酶购自Ferments公司；Taq DNA Polymerase、T4 DNA连接酶、DNA Marker、荧光定量PCR试剂等均购自大连宝生物公司；RNA Purification Reagen、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自TIANGEN公司；其他生化试剂为分析纯级。

1.1.4 引物合成及测序 引物合成及测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 通过木薯转录组数据分析，获得具有HD-domain结构的且与干旱胁迫相关的基因序列；然后将其在木薯基因组数据库（http：//www.phytozome.net/cassava.php）中进行同源比对获得一个电子克隆；根据获得的电子克隆序列设计引物（表1），克隆目标基因。

1.2.2 目的基因序列的克隆 采用天根公司的植物RNA提取试剂盒方法提取木薯总RNA，利用天根公司反转录试剂盒方法合成cDNA第一链。根据设计的引物，克隆木薯目标片段；采用高保真酶进行PCR扩增，PCR反应条件为：98 ℃ 10 s， 55 ℃ 10 s， 72 ℃ 2 min， 35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物经凝胶回收后与pMD18-T载体相连，转化DH5α感受态细胞。将获得的白色单菌落提取质粒，经PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析 利用在线软件进行生物信息学分析：（1）基因结构域分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）； （2）预测MeHDS2分子量及等电点： Compute pl/Mwtool， ExPASy软件（http：//au.expasy.org/tools/pi_tool.html）； （3）蛋白质空间结构预测（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）。

1.2.4 基因表达模式分析 待木薯生长1个月（株高约1 m）后，进行断水干旱处理；14 d后，分别提取木薯SC124的根、叶柄、不同位置叶片总RNA，经DNaseI消化后，反转录成第一链cDNA；采用qPCR（荧光定量PCR）的方法对MeHDS2基因的表达谱进行分析。

1.2.5 植物表达载体构建 植物表达载体的构建过程如图1-A所示。具体过程如下：（1）克隆中间载体pMD18-MeHDS2和植物表达载体pCAMNBIA1300 ∶ GFP质粒各约2 μg，经限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ37 ℃消化3 h后，凝胶回收目的条带；（2）利用T4 DNA连接酶将MeHDS2目的片段与pCAMNBIA1300：GFP大片段于16 ℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞；（3）对重组质粒进行酶切、PCR鉴定，最终将阳性克隆命名为pCAMBIA1300 ∶ GFP ∶ MeHDS2。

通过酶切连接方法[12]进行RNA干扰载体的构建，其过程如图1-B所示。根据MeHDS2基因特异区段设计正反向引物，经PCR扩增得到目标片段（测序分析为阳性）；利用正反向引物中单一的酶切位点，将MeHDS2基因正反向的2条互补臂分别与一段内含子序列（环结构）两端连接，形成“颈环”结构；然后利用“颈环”结构两端的内切酶位点，将“颈环”结构插入表达载体pCAMBIA1300中，构建形成MeHDS2基因的干扰载体。提取质粒用于后续的基因功能分析。

将构建好的植物表达载体通过冻融法（于液氮中放置5 min后，以42 ℃水浴5 min）转化农杆菌LBA4404感受态细胞，在含有25 mg/L Rif+、50 mg/L Kan+和25 mg/L Chl+的YEB平板中培养，PCR鉴定为阳性的克隆（命名为LBA4404/1300 ∶ GFP ∶ MeHDS2），可进行后续的基因功能验证实验。

1.2.6 亚细胞定位 收集LBA4404/1300 ∶ GFP ∶ MeHDS2（OD600为0.8）菌体，重悬菌液，采用针筒注射的方法，将其注射至烟草叶片背部细胞，共培养72 h后，采用共聚焦显微镜观察，拍照分析。

2 结果与分析

2.1 MeHDS2基因克隆与序列分析

通过木薯转录组测序结果与木薯基因组数据进行BLAST比对，获得一个差异表达基因序列的电子克隆；针对该电子克隆序列两端设计特异引物，以SC124 cDNA为模板扩增，获得一个具有完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的长为2 529 bp的基因序列（图2）。经结构域分析发现该基因序列包含1个HD 结构域（含59个氨基酸）、1个START结构域（含205个氨基酸）、1个b-zip结构域（含64个氨基酸）和1个MEKHLA结构域（图3）。NCBI数据库BLAST结果表明，该序列与杨树HD-Zip ClassⅢ蛋白（GeneBank序列号为gb|AAX19050）及棉花HD-Zip ClassⅢ蛋白（Gen Bank序列号为： gb|AAY33856）等具有很高的同源性（>92%）。

MeHDS2基因编码842个氨基酸，预测其分子量为91.86 ku，等电点（PI）为5.90；通过对MeHDS2蛋白的空间结构预测分析，发现其具有3个螺旋结构（图4）。

2.2 植株体内MeHDS2基因对干旱的响应

选取生长1个月的木薯SC124，进行干旱处理14 d后，提取叶片、叶柄和根的总RNA（图5-A），反转录合成第一链cDNA，针对基因区特异性片段设计引物，采用qPCR分析MeHDS2基因在木薯不同组织中的表达模式。结果（图5-B）显示，干旱处理14 d的木薯不同组织中，MeHDS2基因的表达量存在差异，自上而下第三至第四片叶子中，该基因表达量明显较其他部位叶片、叶柄及根中的高。

2.3 植物表达载体构建

为了解MeHDS2蛋白的功能，将MeHDS2基因与GFP基因进行融合，构建了该基因的过表达植物载体；同时选取其特异区段，采用酶切连接方法，构建了其RNAi植物表达载体。PCR及双酶切鉴定结果表明目标表达载体构建成功（图6）。

2.4 MeHDS2蛋白的亚细胞定位

将携带有1300 ∶ GFP ∶ MeHDS2表达框的LBA4404菌株通过注射的方法转化烟草叶片，将培养72 h后的叶片经20%甘油处理后进行压片，置于激光共聚焦显微镜下观察。结果（图7）表明，融合了GFP的MeHDS2蛋白在烟草叶片细胞的核内特异表达，表明MeHDS2蛋白定位于细胞核内。

3 讨论与结论

木薯属于耐干旱、耐贫瘠的作物，其作用机理尚无明确的报道。对木薯抗旱基因的克隆及抗逆作用机理的研究，无论是对其他物种的遗传改良还是自身品种改良都有重要作用。本研究从SC124木薯品种中克隆得到一个MeHDS2基因。空间结构分析表明：（1）该蛋白具有典型的3个螺旋结构，HD-Zip家族多是这个结构[5]；（2）该基因具有1个保守的HD结构域、1个b-zip结构域、1个START结构域（Steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer），因此，该基因应该属于HD-Zip家族中的一员；（3）该基因的3′末端具有一个MEKHLA结构，此结构域是HD-ZipⅢ亚家族的一个标志，该结构域与PAS结构域具有相似性，广泛存在于生物界，可能对光、氧具有感知作用[13]。因此，推断MeHDS2蛋白归属于HD-ZipⅢ亚家族。转录因子是细胞中重要的调节机制[14]，目前得到的HD-Zip家族成员多数定位于细胞核中[15]。亚细胞定位实验表明MeHDS2蛋白同样定位于细胞核中。

已有的研究结果表明，参与植物抗旱生理过程的HD-Zip家族成员主要属于Ⅰ亚家族和Ⅱ亚家族[5]。本研究克隆得到的MeHDS2基因属于HD-ZipⅢ亚家族成员，其在木薯常规（对照）与干旱处理组织中差异表达，说明MeHDS2基因参与木薯耐干旱生理过程。干旱处理条件下，MeHDS2基因在木薯不同组织中的表达模式存在差异，该基因在植株自上而下第三至第四片功能叶中的表达量明显较其他部位叶片、叶柄及根中的要高，此时，植株底部叶片萎蔫或脱落，只有顶部叶片正常伸展并进行光合作用。因此推测，木薯干旱胁迫条件下，MeHDS2基因在维持叶片正常的生理过程（光合作用、维持正常水势）中起作用。由于顶芽处于分裂旺盛期，尚未发育成功能叶，所以此时MeHDS2基因的表达没有明显增强。

目的基因的分子生物学研究需要构建含有目的基因的植物表达载体[16]；同时，为充分研究目标基因的功能，在构建过量表达载体的同时也应构建相应的干扰载体。RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术被广泛应用于基因功能的发掘和基因表达调控，是分子生物学研究中一个重要的、有力的工具。RNAi是生物体内由短片段双链RNA分子介导的并特异性降解与之同源的mRNA[17-19]，从而诱发基因沉默的现象[20-23]。为了能够更直观地检测目标基因的表达情况，笔者将目标基因与GFP基因融合，导入表达载体中，这为研究MeHDS2基因在木薯生长发育过程中的作用提供了技术平台。

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