高佳佳等

摘 要 胶乳转化酶（Invertase，Inv）是控制橡胶树胶乳蔗糖代谢和影响胶乳（橡胶）产量的关键酶。已有研究证实了胶乳转化酶属于中性/碱性转化酶。本研究以热研7-33-97（2n=36）为材料制备叶片细胞染色体标本，采用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）对胶乳转化酶基因HbNIN1、HbNIN2和HbNIN3进行了染色体物理定位的初步研究。结合核型分析，初步确定HbNIN1基因位于5号染色体的长臂上，其信号位点到着丝粒的百分距离为33.1；HbNIN2基因位于2号染色体的长臂上，其信号位点到着丝粒的百分距离为 35.7；HbNIN3基因位于3号染色体的短臂上，其信号位点到着丝粒的百分距离为40.42。由此揭示了该基因家族在染色体上的位置和分布特点。

关键词 巴西橡胶树；转化酶；HbNIN1；HbNIN2；HbNIN3；荧光原位杂交

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Chromosome Location of HbNIN Family Gene

from Hevea brasiliensis

GAO Jiajia1，2， WANG Ying1， GAO Heqiong1， ZHU Wen1， ZHUANG Nansheng1*

1 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource/College of Agronomy， Hainan University， Haikou，

Hainan 570228， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Latex invertase acts as one of the key enzymes regulating the sucrose metabolism and determining the latex yield. It is verified that latex invertase belongs to the category of neutral/alkaline invertases. In this study， chromosome specimens were prepared with immature leaves of Reyan7-33-97， FISH was used to physically locate HbNIN1、HbNIN2 and HbNIN3 gene of H. brasiliensis. The results showed that HbNIN1 gene was located on the long arm of chromosome 5， the percent distances from the gene locus to centromere was 33.1； the HbNIN2 gene was located on the long arm of chromosome 2， the percent distances from the gene locus to centromere was 35.7； the HbNIN3 gene was located on the short arm of Chromosome 3， the percent distances from the gene locus to centromere was 40.42. It reveals the location and distribution of the gene family on the chromosomes.

Key words Hevea brasiliensis； Invertase； HbNIN1； HbNIN2； HbNIN3； FISH

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.008

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是一种重要的产胶植物，是我国热带、亚热带地区重要的经济作物。橡胶的生物合成是在一种特化的细胞（乳管）中进行[1]，其原料是蔗糖，而蔗糖并不能直接被利用，必须在蔗糖合酶或转化酶的作用下才能被进一步利用。蔗糖合酶主要存在于细胞质中，在尿苷二磷酸催化下，可逆地催化蔗糖裂解为尿苷二磷酸和果糖；转化酶（Invertase，Inv）可以催化蔗糖不可逆的裂解形成葡萄糖和果糖，是植物降解蔗糖的关键酶[2-4]。Barratt等[5]发现在糖代谢过程中转化酶的作用要远远大于蔗糖合酶。根据最适酶活pH值的不同可将转化酶分为酸性转化酶（Acid invertase，Ac-Inv）和中性/碱性转化酶（Neutral or alkaline invertase，N/A-Inv）两类。Tupy[6-10]研究证实胶乳转化酶是橡胶树胶乳代谢的限速酶；该酶位于细胞质，最适的酶活pH值为7.25～7.40，属于中性/碱性转化酶，是决定橡胶胶乳产量的关键酶。中国热带农业科学院唐朝荣课题组已先后克隆了3个橡胶树胶乳转化酶基因的全长cDNA，其中刘术金[11]克隆了2个，分别命名为HbNIN1、HbNIN2序列，已提交GenBank（GU573728和GU573727）。而HbNIN3也已克隆出但尚未发表。刘术金[11]研究了在不同条件下HbNIN1与HbNIN2在橡胶胶乳中的表达特性。戚继艳等[12]分析了HbNIN2基因在巴西橡胶树嫩皮和中脉中的 RNA原位杂交。蓝基贤[13]利用Western blot技术研究了在蛋白水平HbNIN2基因的表达情况。但是关于这3个基因在橡胶染色体上的具体位置尚未明确。

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传学技术。该技术除了保持其他原位杂交能够确定探针所杂交的具体位点，精确地定位目的基因[14-l5]的特点外，还具备安全、快速、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高等优点[16]。本实验利用荧光原位杂交技术对HbNIN1、HbNIN2及HbNIN3基因进行了物理定位。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以巴西橡胶树无性系热研7-33-97（2n=36）为材料制备叶片细胞染色体标本。采自海南大学（儋州校区）农学院基地。

Taq DNA聚合酶和DNA Marker购自TaKaRa公司；DNA快速纯化/回收采用北京鼎国公司的DNA快速纯化/回收试剂盒；果胶酶购于Serva；纤维素酶（Cellulase“Onozuka”R-10）购于Japan Yakult；地高辛切口平移试剂盒（DIG-NiCk Translation Mix for in situ probes）购于Roche公司；Jackson的Alexa Fluor 488-IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin、Alexa Fluor 488-AffiniPure Mouse Anti-Rabbit IgG、Alexa Fluor 488-AffiniPure Rabbit Anti-Mouse IgG；DAPI购于Sigma公司；引物合成由Invitrogen（上海）公司完成。

1.2 方法

1.2.1 染色体标本的制备 染色体标本的制备主要参考高和琼[17]等的方法。将酶液浓度提高为5%纤维素酶（Lellulase“Onozuka”R-10，Japan Yakult）和4%果胶酶（Serva，Easiseal）混合液，37 ℃酶解7 h左右（根据叶片大小不同以及材料的固定时间不同，酶解时间有所差异）。

1.2.2 基因片段的PCR扩增与回收 本研究用于HbNIN基因家族基因片段扩增的DNA模板及引物序列均由中国热带农业科学院橡胶研究所唐朝荣课题组惠赠（表1）：包括用于HbNIN1、HbNIN2基因组片段扩增的基因组DNA和引物，以及用于HbNIN3基因扩增的cDNA及引物。经如下程序扩增：94 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 3.5 min，35个循环，72 ℃ 10 min。将扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。之后采用北京鼎国公司的DNA快速纯化/回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收，具体操作参照产品说明书。由于HbNIN3基因序列未发表，暂时不便公布序列及引物信息。

1.2.3 探针的制备 采用Roche公司的地高辛切口平移试剂盒（DIG-Nick Translation Mix for in situ Probe）标记制备探针，具体操作参照产品说明书进行。参考卢圣栋[18]乙醇沉淀纯化法纯化探针。探针标记完成后，向20 μL探针标记反应液中加入10 mg/mL E.coli tRNA 2 μL、10 mg/mL鲑鱼精DNA 2 μL和4 mol/L醋酸铵2.5 μL，然后加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后稍离心，置于-70 ℃ 3 h以上。4 ℃下13 000 r/min离心20 min，沉淀探针DNA，去上清，室温下干燥DNA，再用去离子甲酰胺溶解探针，使探针终浓度为50 ng/μL。

1.2.4 荧光原位杂交 参照邱海燕[19]的方法进行荧光原位杂交。为了提高信号检出率作者对FISH的操作过程稍作修改：染色体标本进行预处理中用0.01 mol/L HCl溶液取代2×SSC溶液；采用Alexa Fluor 488抗体代替FITC抗体；将杂交后的洗脱时间延长至10 min。

1.2.5 图象检测与分析 用荧光显微镜观察，Penguin/Proseries Camera systems软件拍照，用Photoshop软件进行图片处理。根据王静晖等[20]报道的扩增信号位点的百分距离的计算方法结合核型分析确定信号位点在染色体上的具体位置。具体计算方法如下：

扩增信号位点的百分距离=

×100

2 结果与分析

2.1 目的片段的扩增

采用中国热带农业科学院橡胶研究所唐朝荣课题组惠赠的引物，以巴西橡胶树基因组为模板，对HbNIN1、HbNIN2基因基因组片段进行扩增；采用惠赠的模板cDNA及引物进行HbNIN3基因片段的扩增（图1）。HbNIN1基因基因组片段长度为950 bp左右（泳道1）；HbNIN2基因基因组片段长度为950 bp左右（泳道3）；HbNIN3基因片段长度为2 000 bp左右（图1泳道5）。并对HbNIN1、HbNIN2扩增片段进行测序，对测得序列与HbNIN1、HbNIN2基因基因组全长进行BLAST比对，比对结果显示片段相似性都达99%，这就说明这两段扩增序列确实为HbNIN1、HbNIN2基因组片段。并对HbNIN1、HbNIN2、HbNIN3扩增片段进行相互比对，结果显示两两序列之间没有相似性，可制备FISH所用探针进行3个基因的物理定位分析。

2.2 探针标记的检测

本研究使用切口平移试剂盒进行探针的标记，经1%琼脂糖凝胶电泳检测（图1）。结果显示：标记后的探针呈弥散的条带，片段大小主要集中在200～600 bp，且条带分布均匀。这就说明扩增片段已经被成功地标记，标记后的探针长度适宜且分布较均匀，能够用于后续的荧光原位杂交。

2.3 HbNIN基因家族FISH结果与分析

HbNIN基因家族在热研7-33-97有丝分裂不同时期的叶片细胞中均可检测到杂交信号，其中以出现 2个杂交信号居多。以高和琼[21]等报道的热研7-33-97的核型为依据，对这些含有杂交信号位点的中期细胞进行核型分析，得到了如图2-C、图3-C和图4-C所示的核型图，以及如图5所示的核型模式图。HbNIN1基因位于5号染体的长臂上，其信号位点到着丝粒的百分距离为33.1（图2-C、图5）；HbNIN2基因位于2号染色体的长臂上，其信号位点到着丝粒的百分距离为35.7（图3-C、图5）；HbNIN3基因位于3号染色体的短臂上，其信号位点到着丝粒的百分距离为40.42（图4-C、图5）。

2.4 巴西橡胶树热研7-33-97核型模式图

根据高和琼[21]得到的巴西橡胶树热研7-33-97的核型数据制作核型模式图，图5为本研究定位的3个基因HbNIN1、HbNIN2、HbNIN3基因在热研7-33-97的染色体上的位置分布，由图5可知，3个基因位于3条不同的染色体上因此为独立基因。

2.5 信号检出率统计结果

为了保证结果的准确性，本研究在进行了HbNIN1、HbNIN2及HbNIN3基因的杂交时都观察了350个以上的细胞，并对观察结果进行了简单的统计分析，具体分析结果见表2。由表2可以看出，3个基因的信号检出率都在20%以上，且在所有能够检出信号的细胞中，有2信号位点的细胞占80%左右，也有少部分细胞出现1个信号点及3个信号点的现象。

3 讨论与结论

探针一直是影响杂交效果的重要因素之一，对于基因家族的杂交定位来讲，如何通过设计不同的探针来进行各家族成员之间的有效区分，是需要首要考虑的问题之一。胶乳转化酶HbNIN1、HbNIN2和HbNIN3同属于胶乳转化酶HbNIN基因家族，其中HbNIN1、HbNIN2的cDNA之间同源相似性很高，达到98%，而HbNIN3与HbNIN1、HbNIN2之间没有同源性。刘术金[11]在进行HbNIN1、HbNIN2的Southern杂交时，就选用这2个基因同源性最低的基因组片段进行探针引物的设计，并以橡胶树基因组DNA为模板，成功地扩增出这2个基因的基因组片段，但由于Southern杂交的实验条件不够优化，导致结果不够理想，只能推测这2个基因为单低拷贝基因。本研究继续采用刘术金设计的探针引物，扩增出HbNIN1、HbNIN2基因组片段与刘术金所扩增片段结果一致。扩增片段测序后经比对证实这2个探针片段的确来自HbNIN1、HbNIN2基因组全长，且2个片段之间没有相似性，可以用于FISH制备探针。而由于同家族的HbNIN3基因与HbNIN1、HbNIN2基因之间没有同源性，因此可以直接以HbNIN3的cDNA序列制备探针进行该基因的物理定位研究。探针的长度也是影响杂交效果的因素之一，适宜长度的探针，能够穿透组织，顺利接近靶位置，与靶序列形成稳定双链，而且形成的杂交体受环境影响小，不易被洗脱。李璇[22]认为探针长300～500 bp时可达到最大的杂交率。余朝文[23]认为探针长度在300 bp左右的杂交效果较好。本研究采用切口平移法进行探针的标记，标记后探针长度主要集中在200～600 bp之间，能够用于后续的荧光原位杂交。

本研究对3个HbNIN家族基因进行物理定位的结果进行统计分析发现，在所有能够检测到信号的细胞中，有2信号位点的细胞占80%左右，因此认为这3个基因都应该属于单拷贝基因，这与刘术金的推测是一致的。而有1个信号位点及3个位点的细胞约占所有能够检出信号细胞的16%及4%。笔者认为这些可能为不理想的杂交结果，并初步分析了出现这些不理想现象的原因：（1）出现多个信号主要是因为非特异性杂交或未杂交上的探针分子，没有在杂交后的洗脱中被顺利除去，造成了假阳性的信号干扰。荣小营[24]认为杂交后的洗脱是提高信号检出率的重要因素之一，因此应选择适宜的洗脱时间。（2）出现1个杂交信号可能的原因：一是DNA变性不太成功，导致探针无法顺利与靶序列结合；二是洗脱时间可能过长，把与靶序列结合的探针洗脱下来，造成信号点少甚至没有信号点的现象；三是有细胞壁和细胞质碎片的存在，使探针与靶序列杂交相当困难，同时荧光信号一般为小圆点，非常容易猝灭，因此要及时捕捉杂交信号也是不容易的[25]，因此制备出背景较干净的叶片细胞染色体标本至关重要。为了提高有效的杂交信号的检出率，根据前期试验所出现的问题，对杂交条件做了部分调整，挑选了更为优质的标本，延长了标本变性的时间，选择了更为适合的洗脱时间。通过这些调整，有效地提高了杂交信号的检出率，达到了较为理想的效果。

研究表明，橡胶树胶乳转化酶活性和橡胶树胶乳产量有很大的相关性，是影响胶乳代谢和再生的关键酶之一[10]，因此胶乳转化酶基因在橡胶树乳管蔗糖代谢和胶乳再生调控中具有举足轻重的地位。本研究利用FISH技术将HbNIN1、HbNIN2和HbNIN3分别定位于巴西橡胶树热研7-33-97的第5号、第2号和第3号3条不同的染色体上。研究结果表明，这3个基因互为独立基因，其中HbNIN1基因与高和琼[26]定位的死皮病基因HbMyb1都位于5号染色体的长臂上，两者为连锁基因且两者之间的距离为17.89；HbNIN3基因与邱海燕[19]定位的REF基因也是连锁基因，但前者位于热研7-33-97第3号染色体短臂上，后者位于长臂上；而HbNIN2基因目前并未找到与之连锁的基因。通过对HbNIN基因家族进行物理定位有助于进一步了解该家族基因的位置关系、分布特点，及与其他基因的关系，确定现有的橡胶遗传图谱的准确性及完整性，为染色体微切割，建立含转化酶基因的特定染色体片段的基因文库，进而分离和利用这些基因提供某些依据，同时还可以为橡胶树遗传育种、基因工程以及比较基因组学研究提供分子细胞遗传学依据。

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