雷旭光 张永玉 董岩 杨宪鲁

[摘要]目的：进一步探讨真皮多能干细胞 (dermal multipotential stem cells,DMSCs) 移植对大鼠皮肤光老化（skin photoage）后组织修复作用的影响。方法：SD大鼠58只随机分为正常对照组（8只）、细胞移植组（25只）和PBS对照组（25只），细胞移植组和模型对照组采用UVA和UVB紫外灯同时进行照射制备皮肤光老化模型。体外分离培养DMSCs，吸取1ml细胞悬液（约1×106个）或等量PBS液分别于皮肤光老化区真皮层内多点注射移植，正常对照组不做任何处理。移植后4周、8周分别采用VG染色和Weigert染色观察皮肤全层胶原纤维、弹力纤维的表达变化；同时应用免疫组织化学染色观察各组大鼠皮肤真皮层vimentin的表达变化。结果：皮肤光老化损伤后，与对照组相比, DSMCs治疗组大鼠受损皮肤组织出现较多的新生胶原纤维和弹力纤维； DMSCs移植治疗组大鼠在真皮层内vimentin染色阳性的成纤维细胞的数量明显多于PBS对照组，移植后4周主要分布于真皮浅层，8周后广泛均匀弥散在皮肤各层。结论：DMSCs 移植对大鼠光老化皮肤具有明显的促进组织修复的作用。

[关键词]真皮多能干细胞；皮肤光老化；移植; 大鼠

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2014）09-0726-04

Treatment skin photoaging of rat by dermal multipotential stem cells

LEI Xu-Guang,ZHANG Yong-yu,DONG Yan,YANG Xian-lu

(Department of Medical Cosmetic Surgery,Weihai Hospital,Weihai 264200,Shandong,China)

Abstract:ObjectiveTo explore further effect of histological repair for skin photoaging in rats by dermal multipotential stem cells (DMSCs) transplantation.Methods 58 SD rats were randomly divided into normal group (8 rats) ,cell transplantation group(25 rats) and PBS control group(25 rats).The rats of cell transplantation group and PBS control group were made into skin photoaging model by using the UVA and UVB ultraviolet light irradiated at the same time. DMSCs were isolated in vitro, then 1 ml cell suspension of DMSCs (about 1×106) or equivalent PBS were multi-point injected into photoaging skin of rats, rats of normal group did not make any processing. After 4 weeks and 8 weeks of cell transplanted, the collagen fibers and elastic fibers changes in full layer of photoaging skin were observed by using VG and Weigert staining respectively. Meanwhile,the expression change of vimentin in dermis layer were detected by using immunohistochemistry staining.Results After photoaging damaged, there are more new collagen fibers and elastic fibers in damaged skin tissue were observed in the DMSCs transplantation group, and the number of fibroblast which are vimentin positively staining in dermis layer of rats in DMSCs transplantation group were obviously more than PBS control group, which were mainly distributed in the dermis superficial layer at 4 weeks after cell transplanted, and observed in full dermis layer 8 weeks post cell transplantation.ConclusionDMSCs transplantation could obviously benefit to repair the damaged tissue of skin photoage.

Key words:dermal multipotential stem cells; skin photoage; transplantation; rats

皮肤光老化后引起皮肤粗糙、松弛、萎缩，出现皱纹和色素沉着，毛细血管扩张、紫癜甚至诱发皮肤癌，严重影响人类健康和美容[1]。光老化后皮肤组织中成纤维细胞的数量和质量下降、胶原纤维和弹力纤维发生变性降解，导致皮肤不足以维持正常的组织构建。目前所具有的治疗手段均不能使这些病理变化得以有效逆转。真皮多能干细胞(dermal multipotential stem cells，DMSCs)是存在于真皮组织中的一类具有高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，研究显示，DMSCs可在一定条件下不仅可分化成纤维细胞，还能向成骨细胞、软骨细胞、神经样细胞转化[2-3]，在组织修复和再生医学领域中有着广阔的应用前景。但目前先有利用DMSCs治疗组织损伤相关疾病的报道，本文旨在应用光老化损伤大鼠模型观察DMSCs对组织修复的影响。

1材料和方法

1.1 主要试剂与仪器：DMEM培养基(Gibco公司，美国)；DAPI、II胶原酶（sigma公司，美国）、FBS(Gibco公司，美国)；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰蛋白酶（Hyclone 公司，美国）；兔抗鼠波形蛋白（Vimentin）多克隆抗体、CD34兔抗鼠多克隆抗体（Chemicon 公司，美国）；弹力纤维染色试剂盒、胶原纤维染色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；倒置相差显微镜、荧光显微镜（Olympus公司，日本）；15wUVA和UVB紫外灯（上海西格玛电器有限公司）。

1.2 实验动物：58只成年健康SD大鼠，雌雄各半，体重(210±20)g，第三军医大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXKC（渝）2013-005。

1.3 DMSCs的分离培养[4]：取出生3天的SD乳鼠断颈处死后，75%酒精浸泡5min，无菌剥离背部全层皮肤，以PBS液反复漂洗后，除去脂肪及皮下结缔组织，将其剪成约5mm×5mm大小皮片，用0.5g/ml胶原酶于4℃条件下消化14～16h后，机械分离表皮和真皮，将真皮剪成1mm3大小的组织块，加入0.25%胰蛋白酶于37℃条件下消化30min，用含10%FBS的DMEM培养基终止消化，经300目钢网过滤，收集滤液，1000rpm离心5 min，细胞沉淀悬浮于完全培养液（含DMEM、10ng/ml bFGF、10%FBS，100U/ml青霉素）中，调整细胞密度以2×105个/ml接种于培养瓶内，在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养6h后，更换新鲜培养基以去除未贴壁细胞，继续培养,每3天换液1次。

1.4DMSCs鉴定[5]：取原代培养的DMSCs，将细胞浓度调至1×105/ml接种于预置盖玻片的24孔培养板中，用完全培养基在37℃、 5%CO2饱和湿度条件下培养，1天后细胞贴附于玻片后，取出爬片，通过形态学、CD34免疫荧光染色进行细胞鉴定。

1.5 实验分组及皮肤光老化模型[6]制备：SD大鼠58只，分为正常对照组（8只），PBS对照组（25只）及DMSCs移植组（25只）。所有大鼠均剪除背部约5cm×5cm区域的毛发,正常对照组不做任何处理。PBS对照组和DMSCs移植组则以15W UVA和UVB紫外灯并排置于大鼠背部裸露皮肤区正上方35cm处照射，每日2h，隔日剃除大鼠照射区新生毛发，观察大鼠皮肤变化。连续照射60天后，各组随即取死2只大鼠，行组织病理学检测以确定模型制备成功。

1.6 DMSCs移植：制模成功后，取第三代DMSCs以0.05%胰酶消化制成细胞悬液，PBS洗涤两次，重悬后用PBS调整细胞密度为1×106个/ml备用。DMSCs移植组在大鼠光老化皮肤的上下左右4个区域的真皮深层内，用2ml注射器吸取1ml（1×106 个）细胞悬液直视注射，每个注射点间直径为2cm，与边缘间间隔为1cm，每点0.25ml。PBS对照组以同样的方法注射等体积的PBS液。

1.7 组织学检测：光老化造模成功后，各组分别取2只大鼠处死，取照射部位皮肤组织行胶原纤维染色（VG染色）和弹力纤维染色（Weigert染色）；DMSCs移植后4周、8周处死各组大鼠，取移植区2.5cm×2.5cm大小皮肤组织，常规固定包埋，连续切片（片厚约4μm），分别采用VG染色、Weigert染色及Vimentin免疫组织化学染色观察组织胶原纤维、弹力纤维和成纤维细胞的改变。染色步骤如下：①VG染色：具体操作步骤照试剂盒说明书进行；组织切片常规脱蜡至水，分别滴加碘液、硫代硫酸钠、流水冲洗后，滴加醛品红染液、橙黄G染液，镜下观察控制染色时间，脱水、透明、封片；②Weigert染色：具体操作步骤照试剂盒说明书进行；切片脱蜡水化后，分别滴加苏木素、三氯化铁等量混合液、盐酸分化后，滴加酸性品红和苦味酸混合液染色5～10min，透明、封固后显微镜观察；③Vimentin免疫组织化学染色：切片用3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，高压抗原修复后，5%山羊血清封闭30min，滴加兔抗鼠Vimentin（1:200）多克隆抗体，4℃过夜。二抗为生物素标记羊抗兔IgG，37℃孵育30min，PBS充分洗涤后再滴加SABC复合物室温作用20min，DAB显色，苏木素复染后观察。以胞质呈淡黄色者为阳性。

1.8 统计学处理：所有数据以均值±标准差（x±s）表示，经SPSS17.0统计软件处理。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有显著性意义。

2结果

2.1 大鼠皮肤光老化模型鉴定：大鼠裸露皮肤经紫外灯照射后光老化区出现深大皱纹、变厚变硬、弹性差，毛发脱落，色素沉着等改变；VG染色见胶原纤维断裂，明显变性、均质化，形成块状；Weigert染色弹性纤维增多、变粗、排列紊乱，部分区域聚集、缠结。

2.2 DMSCs形态及鉴定：DMSCs于培养12h后即可观察到部分贴壁，贴壁的细胞大部分为多角形、椭圆形，72h后大部分贴壁细胞变为梭形或多角形，多呈集落样生长；接种6～7天覆盖面积达90%以上，细胞呈放射状或漩涡状排列；免疫荧光检测结果显示：DMSCs胞浆CD34表达阳性，呈明亮的绿色荧光，而不表达上皮细胞标志的CK19，提示该细胞为间质来源，PBS替代一抗的空白对照未见阳性信号。

2.3 DMSCs移植后胶原纤维和弹力纤维的变化：VG染色结果显示，DMSCs移植后4周，在损伤区域皮肤真皮层内聚集、缠结的变性胶原纤维明显减少，并见少量新生胶原（图1C）；至第8周，延伸至皮下组织及真皮深层变性胶原纤维基本消失，出现大量深染、排列有序的新生胶原纤维，皮肤结构层次清晰（图1E）。Weigert染色结果显示，在DMSCs移植组后第4周的真皮层内，变性弹力纤维明显减少（图2C）；第8周则基本消失，组织形态接近正常（图2E）；而对照组仍可见少量变性的弹力纤维分布于组织中（图2F）。

2.4 DMSCs移植后成纤维细胞的变化：波形蛋白免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，DMSCs局部多点注射后4周，移植组可见较多的成纤维细胞，主要分布于真皮浅层；治疗第8周，仍有较多的成纤维细胞散在分布于真皮层；两组间Vimentin染色光密度值具有统计学意义（P<0.01）见表1。

3讨论

近年来大量研究发现，皮肤组织真皮层内存在一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞群即DMSCs，其体外培养呈现纺锤样、长梭形生长形态，表达间充质干细胞典型的表面标记，在一定实验条件下具有促进脊髓神经、软骨缺损等组织修复的作用[7-8]，特别值得一提的是，DMSCs不仅缩短感染创面愈合时间，加速创面修复，还能促进创面皮肤神经修复，在皮肤组织的创伤修复的治疗中具有无可比拟的作用[9]。

笔者前期研究发现，DMSCs移植对于紫外线诱导的光老化皮肤模型大鼠具有良好的治疗作用，但DMSCs移植对光老化皮肤真皮组织内部的病损改变的影响却不得而知。本实验结果显示，无论是变性的胶原纤维还是弹力纤维，DMSCs移植后均得以有效的清除，同时笔者还发现有较多胶原纤维新生。胶原纤维是人体皮肤中最主要的结构蛋白，也是含量最丰富的蛋白质。在真皮中聚集成与皮面平行的粗大纤维束，相互交织成网，是维持皮肤张力和承受拉力的重要成分，也是维持皮肤饱满充盈的物质基础。同时，紫外线照射导致弹力纤维变性，引起异常的、无定形的弹力纤维变性物质在真皮层沉淀，并取代正常的胶原纤维和弹力纤维，使皮肤失去弹性，血管壁变薄，变脆等改变更是皮肤光老化病损改变的病理基础。此种病理转变对维持病损后皮肤组织的外观形态至关重要。

实验中笔者还观察到DMSCs移植后真皮层内成纤维细胞明显多于对照组，说明DMSCs移植可有效延缓皮肤真皮层内成纤维细胞的损伤。成纤维细胞是真皮组织中最重要细胞组分，主要合成分泌胶原纤维、弹力纤维，蛋白多糖等基质。所以笔者大胆推测，DMSCs移植后成纤维细胞的有效存活和功能再生是DMSCs移植治疗皮肤光老化的重要机制之一，然而DMSCs通过何种途径维持成纤维细胞的数量及功能，有待进一步深入研究。

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[收稿日期]2014-03-02[修回日期]2014-04-03

编辑/张惠娟