河北省任丘市卫生学校 刘连臣 张睦清 杜志超（任丘 062550）

益胃祛瘀消痰方为经多年临床筛选出的治疗慢性萎缩性胃炎 （CAG）的经验方，具有益气养阴，祛瘀消痰之功，临床用于治疗CAG具有较好的疗效。本研究采用流式细胞术 （FCM）观察了益胃祛瘀消痰方对CAG大鼠胃组织细胞凋亡与增殖及其相关调控基因Caspase3、Bcl－2和Fas基因蛋白表达的影响，以研究益胃祛瘀消痰方在治疗CAG方面的作用机理。

1 材料

1.1 实验动物 Wistar大鼠，60只，雄性，体质量180～200 g，购自河北省实验动物中心 （合格证号:冀动字1001005）。

1.2 药物和试剂 益胃祛瘀消痰方药物组成:黄芪、丹参、麦冬、炒白芍、炒白术、炙甘草、清半夏、黄连、丁香、陈皮等，采用水煎和醇提相结合方法，将提取液分别浓缩为含生药0.367 g/mL、0.183 g/mL浓度的水溶液。三九胃泰胶囊和维霉素片均用蒸馏水制成0.1 g/mL浓度的混悬液。脱氧胆酸钠购自北京奥博星生物技术有限公司。Fas、Bcl－2和Caspase3一抗单克隆抗体、二抗工作液（羊抗鼠PITC－IgG荧光抗体）均由美国Santa Cruz公司提供。

1.3 主要仪器 Epics－XLⅡ型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司生产。

2 方法

2.1 动物分组与造模 将实验大鼠常规喂养1周后，随机分为正常组、模型组、维霉素组、三九胃泰组、益胃祛瘀消痰方低剂量组、益胃祛瘀消痰方高剂量组，共计6组。动物造模参照相关文献采用的方法［1］即:先灌饲0.2%的脱氧胆酸钠溶液，用量为每只1.5 mL/d，5 h以后，再灌饲50℃的热水，用量为每只2 mL/d，同时加用饥饱失常的喂养方法，（2 d足量喂食，1 d停食），正常组大鼠普通饲料喂养，每天灌饲等量的蒸馏水，造模时间共8周。

2.2 给药方法 造模成功后，开始灌胃治疗，其中，益胃祛瘀消痰方低剂量组和高剂量组分别按照1.83 g/kg、3.67 g/kg的剂量灌胃，维霉素组和三九胃泰组均按照1g/kg的剂量灌胃，正常组和模型组均给予等剂量的蒸馏水灌胃;1次/d，用药体积均按照1 mL/100 g计算。

2.3 胃组织样本制作 治疗5周后，麻醉实验大鼠，股动脉取血后，迅速剖开腹部，分离胃组织，沿胃窦近幽门口至胃大弯方向取适量的胃组织，于生理盐水中冲洗后，以70%乙醇溶液固定，置于冰箱中冷藏待检。

2.3.1 制备单细胞悬液:将固定的胃组织放置于100目的不锈钢网上，网下置一平皿，用剪刀剪碎至1 mm3大小，再用眼科镊子轻搓组织块，边搓边以PBS液冲洗，直至将组织搓完。然后将平皿中的混悬液，用300目筛网过滤以去除细胞团块，收集细胞悬液，500～800 r/min离心2 min，弃去上清，保留沉淀，加入PBS 0.3 mL，稀释混匀后，将单细胞悬液分成4份，调整每份的细胞数为1×106，分别用于检测细胞凋亡、Caspase3、Bcl－2和Fas蛋白表达。

2.3.2 细胞凋亡DNA含量染色:取1×106细胞悬液0.1 mL，加入10%鸡红细胞作为内参标准，与样品同步染色，加入碘化丙啶 （PI）1 mL，在4℃冰箱染色30 min，以500目铜网过滤，上机检测。

2.3.3 Bcl－2、Caspase3、Fas蛋白免疫荧光标记:将鼠抗人单克隆抗体工作液0.1 mL，加入到单细胞悬液1×106/mL中，室温孵育30 min，加入PBS 10 mL洗涤1次，弃去上清液，加入羊抗鼠PITC－IgG二抗工作液100μL，室温孵育30 min，加入PBS 10 mL离心，弃去上清，除去未结合的荧光二抗，再加入PBS 0.1 mL并用500目的铜网过滤后，即可上机检测。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设一抗或二抗的本底作为对照和阴性对照。

2.3.4 检测方法:采用Epics－XLⅡ型流式细胞仪，检测前以 flow－checkTMFluorpheres（10μm）荧光微球作为标准样品调整仪器CV值在2%以内。

2.4 测量资料分析方法 应用MuticycleAV分析软件对DNA细胞周期拟合分析，应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析，以细胞凋亡指数 （AI）表示细胞凋亡程度，细胞增值指数 （PI）代表细胞的增值活性，免疫荧光指数 （FI）表示蛋白表达水平。

3 结果

3.1 益胃祛瘀消痰方对CAG大鼠胃组织细胞凋亡的影响 模型组与正常组比较，胃组织细胞AI值、G0/G1期细胞百分率均明显升高 （P＜0.01）;PI值和 G2/M期以及 S期细胞百分率降低 （P＜0.05）。经药物治疗后，与模型组相比，各治疗组G0/G1期细胞百分率和AI值均明显下降 （P＜0.01）;G2/M期以及S期细胞百分率和PI值均明显增高 （P＜0.01或P＜0.05）;其中，高、低剂量组AI值均低于维霉素组和三九胃泰组 （P＜0.05或P ＜0.01）。结果详见表1。

表1 各组大鼠胃组织细胞凋亡及不同时期增殖时相比率的结果比较（±s），n=10

表1 各组大鼠胃组织细胞凋亡及不同时期增殖时相比率的结果比较（±s），n=10

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与维酶素组和三九胃泰组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 AI G0/G1（%） G2/M（%） S（%）PI正常组 10.31±1.51＊＊ 75.68±6.24＊＊ 9.51±0.66* 14.42±1.55* 23.96±2.46＊＊模型组 24.46±3.12 80.89±8.85 7.73±0.88 11.28±0.92 18.96±1.83高剂量组 14.55±2.78＊＊△△ 73.21±7.71＊＊ 11.55±1.75＊＊ 15.16±1.16* 26.59±2.37＊＊低 剂 量组 15.84±3.03＊＊△ 74.48±8.92＊＊ 11.41±1.92＊＊ 15.38±0.52＊＊ 26.81±3.02＊＊维霉素组 17.83±2.89＊＊ 75.83±6.84＊＊ 10.82±1.52＊＊ 14.18±1.73* 24.92±2.63＊＊三九胃泰组 17.41±3.88＊＊ 75.49±5.65＊＊ 11.16±1.28＊＊ 13.69±0.88* 24.89±1.13＊＊

3.2 益胃祛瘀消痰方对CAG大鼠胃组织细胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表达的影响 模型组与正常组比较，大鼠Caspase3和Fas蛋白表达FI值均升高，而 Bcl－2蛋白表达 FI值降低 （P＜0.01或P＜0.05）。经用药治疗后，各治疗组Fas、Caspase3蛋白表达FI值均低于模型组，Bcl－2蛋白表达FI值均高于模型组 （P＜0.05或P＜0.01）;其中，高、低剂量组的Caspase3蛋白表达FI值均低于维霉素组和三九胃泰组 （P＜0.05或P＜0.05）;高剂量组Fas蛋白表达FI值低于低剂量组、维霉素组和三九胃泰组 （P＜0.05或P＜0.01）。结果详见表2。

表2 各组大鼠胃组织细胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表达变化（±s），n=10

表2 各组大鼠胃组织细胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表达变化（±s），n=10

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与维酶素组和三九胃泰组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别Caspase3 FI Fas FI Bcl－2 FI正常组 1.03±0.01＊＊ 0.83±0.13＊＊ 1.00±0.15＊＊模型组 1.32±0.03 1.28±0.21 0.74±0.21高剂量组 1.06±0.02＊＊△ 0.89±0.12＊＊△△ 0.98±0.19＊＊低剂量组 1.07±0.03＊＊△ 1.08±0.23* 0.95±0.11＊＊维霉素组 1.18±0.03＊＊ 1.12±0.21* 0.92±0.08＊＊三九胃泰组 1.16±0.02＊＊ 1.06±0.18* 0.97±0.11＊＊

4 讨论

中医学中无CAG的病名，根据其临床表现可归属于中医的“胃痞”“胃脘痛”“嘈杂”等疾病范畴，其病因多是由于饮食不节、或情志不遂、或操劳过度，损伤脾胃等，渐致脾胃损伤，气机失调，胃络瘀阻，湿阻痰生。气阴不足，痰瘀互阻为本病的主要病机，益气养阴，祛瘀消痰为其有效治疗方法。故益胃祛瘀消痰方中选用黄芪、白术、茯苓益气健脾，麦冬、炒白芍、炙甘草酸甘化阴，柔肝和胃，丹参、赤芍、莪术活血祛瘀，清半夏、白芥子燥湿消痰，陈皮、黄连、丁香通降胃气。诸药合用，脾气得补，胃阴得充，气机得畅，血脉畅通，湿祛痰生，故治疗CAG可获满意的疗效。

胃组织细胞的过度凋亡，可严重影响胃的生理功能。Bcl－2与Fas是与细胞凋亡关系较为密切的基因，两者的作用各不相同。Bcl－2基因主要作用是通过抗细胞凋亡，以延长细胞寿命，促进细胞生存 。［2］Fas基因为细胞膜表面受体蛋白，它是与T淋巴细胞膜上Fas－L结合，向细胞内传递“死亡信号”，诱导靶细胞发生凋亡［3］，Caspase3是Caspase家族成员之一，是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，Caspase3介导的凋亡在人体多种类型细胞中普遍存在着，其降解凋亡标志性底物的活性最强。Caspase3可被该家族其它成员如Caspase9和6激活。Bcl－2，Bcl－xL等抗凋亡蛋白可通过与Fas等促凋亡蛋白形成异二聚体阻止线粒体释放细胞色素 C（cyt－c），或直接与 a－paf－1、Caspase9结合成三元复合物从而阻止Caspase9途径的激活，Caspase3不能被活化，因而细胞凋亡受抑制。［4］本项研究结果表明，模型组大鼠的胃组织中细胞凋亡率最高，同时 Bcl－2表达量最低，Caspase3和Fas表达量最高;说明Caspase3和Fas表达上调、Bcl－2表达下调，是造成细胞凋亡增加的原因之一。经药物治疗后，与模型组相比，各治疗组Bcl－2表达量明显增加，Caspase3和Fas表达量明显降低，细胞凋亡率明显下降，说明益胃祛瘀消痰方能够加速胃组织细胞的DNA合成及分裂增殖，抑制胃组织细胞过度凋亡，以保证胃组织细胞的正常功能，从而达到抗CAG的作用，此可作为益胃祛瘀消痰方治疗CAG的作用机制之一。

［1］ 李红平，毛万姬，邹学正.丹白麦门冬汤对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜病理形态学的影响 ［J］.陕西中医，2007，28（2）:243－245

［2］ LalierL，Cartron PF，Juin P，et a1.Bax activation and mitochon－ drial insertion during apoptosis ［J］ .Apoptosis，2007，12（5）:887－896

［3］ Lockshin RA.Programmed celldeath:history and future ofa con －cept［J］ .JSoc Biol，2005，199（3）:169 －73

［4］ 于利利，王泽华.Bcl－xL和Caspase3在人卵巢癌细胞株凋亡过程中的调节作用 ［J］.华中科技大学学报 （医学版），2003，32（2）:205－207

（2014－03－07 收稿）