赵远红，左晓娜，韩素恒，徐 雨，贾英杰，李 正，3

（1.天津中医药大学第一附属医院肿瘤科，天津 300193；2.天津中医药大学研究生院，天津 300193；3.天津中医药大学第一附属医院制剂室，天津 300385）

益肝降脂方预处理对酒精性脂肪肝大鼠氧化应激的影响*

赵远红1，左晓娜2，韩素恒2，徐 雨2，贾英杰1，李 正1，3

（1.天津中医药大学第一附属医院肿瘤科，天津 300193；2.天津中医药大学研究生院，天津 300193；3.天津中医药大学第一附属医院制剂室，天津 300385）

[目的]观察不同浓度益肝降脂方（YGJZF）在不同时段干预酒精性脂肪肝(AFLD)大鼠的氧化应激效应，分析探讨YGJZF对AFLD大鼠的抗氧化作用及其可能机制。[方法]97只SD大鼠随机分为模型组22只、中药YGJZF组75只，据干预时段和用药浓度不同,中药组分为中药3 w-Ⅰ及Ⅱ组、中药6 w-Ⅰ及Ⅱ组、中药9 w-Ⅰ及Ⅱ组共6组。采用梯度乙醇灌胃加高脂饲喂法造模。中药各组自第3、6、9周起予等效剂量[13.95g/（kg·d）]和高剂量[27.9 g/（kg·d）]灌胃，模型组均予生理盐水15 mL/kg灌胃,至12周末。于第6、9、12周末观察大鼠血清8-异前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）含量，肝匀浆丙二醛（MDA）含量、黄嘌呤氧化酮（XOD）活性及病理变化。[结果]与各相应时段模型组比较:第6周末,中药3 w-Ⅱ组大鼠血清8-iso-PGF2α含量及肝匀浆MDA含量、XOD活性明显降低（P＜0.05）；第9周末的中药6 w组及第12周末的中药3 w、6 w、9 w各组大鼠血清8-iso-PGF2α含量、肝匀浆MDA含量、XOD活性均明显降低（P＜0.05），且均以II组更明显；第12周末，中药组各指标降低顺序为中药3 w组＞中药6 w组＞中药9 w组；中药3 w-Ⅰ组及9 w-Ⅰ组8-iso-PGF2α、MDA含量均较中药6 w-Ⅰ组有统计学意义（P＜0.05），中药3 w-Ⅱ、9 w-Ⅱ组8-iso-PGF2α含量均较中药6 w-Ⅱ组差异有统计学意义（P＜0.05），中药Ⅱ组各指标均低于中药Ⅰ组，其中中药3 w组8-iso-PGF2α和MDA、XOD，中药6 w组8-iso-PGF2α和MDA，中药9 w组XOD均存在统计学差异（P＜0.05）；第6、9、12周末，中药各组HE病理示肝脏脂肪变均较模型组不同程度减轻，且以Ⅱ组更明显；第12周末，中药3 w组脂肪变轻于中药6 w组，中药6 w组稍轻于中药9 w组。[结论]中药YGJZF不同时段干预均能降低乙醇诱导SD脂肪肝大鼠氧化应激损伤，且越早期干预抗损伤效应越突出，不同程度抑制了酒精肝大鼠的病理损伤，并呈现一定时间和浓度依赖性，为临床AFLD防护的用药与时机选择提供了实验依据。

益肝降脂方；酒精性脂肪肝；氧化应激；预处理；病理

益肝降脂方（YGJZF）为防治酒精性脂肪肝（AFLD）的临床验方，经多年临床证实疗效确切，且前期研究[1]表明其可能有类抗氧化剂样效用。氧化应激与脂质过氧化是酒精性肝病（ALD）最重要发病机制[2]，成为近年研究的热点。本实验应用不同浓度YGJZF对AFLD大鼠造模过程进行不同时段干预，观察大鼠血清8-异前列腺素F2α(8-iso-PGF-2α)含量、肝组织匀浆丙二醛（MDA）和黄嘌呤氧化酶（XOD）活性变化及对肝组织病理形态学的影响，从实验的角度分析探究YGJZF的抗氧化作用。

1 材料

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量（170± 10）g，购自中国人民解放军军事医学科学院，合格证:0024259，许可证：SCXK-（军）2007-004，饲养于天津中医药大学第一附属医院动物房，饲养环境符合医学实验动物环境设施相关要求。

1.2药物及造模 益肝降脂方（YGJZF：黄芪、丹参、葛根、黄连、苏叶、水红花子），由本院制剂室按固定比例制成含生药1.33 g/mL的中药浓缩液。高脂饲料（购自中国人民解放军军事医学科学院）配方：1%胆固醇、8%蛋黄粉、0.3%胆酸钠、10%猪油、80.7%基础饲料。56°牛栏山二锅头(北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂生产，购自天津市家乐福超市)。

1.3试剂 肝组织MDA测定试剂盒（批号201302 18）、肝组织XOD测定试剂盒（批号20130215）、大鼠8-iso-PGF2α酶联免疫分析试剂盒（批号201302 01A）。均购自南京建成科技有限公司。苏木精-伊红（HE）染料（本院病理科自行配制）。

1.4主要仪器 分光光度计（上海722RS型），离心机（北京雷勃LDZ5-2型），LAUDA-C3型循环恒温水浴箱（泰克仪器有限公司）、光学显微镜（日本OLYMPUS公司）、全自动酶标仪（美国Bio-Tek 800）。

2 方法

2.1分组与造模 1周适应性饲养后，97只SD大鼠按随机数字表法随机分为模型组22只、中药YGJZF组75只，考虑到饲喂损伤，据干预时段和用药浓度不同，后者又随机分为第3周起干预组即中药3w-Ⅰ组18只，中药3 w-Ⅱ组19只；第6周起干预组中药6 w-Ⅰ组12只、中药6 w-Ⅱ组12只；第9周起干预组即中药9w-Ⅰ组7只，中药9w-Ⅱ组7只，共6组。参照文献[3]与预实验[4]采用梯度乙醇灌胃加高脂饲喂法造模。

2.2给药与取材 造模同时乙醇灌胃半小时后，中药3 w-Ⅰ、6 w-Ⅰ、9 w-Ⅰ组和中药3 w-Ⅱ、6 w-Ⅱ、9 w-Ⅱ组均分别自第3、6、9周起，分别予等效剂量13.95 g/（kg·d）和高剂量[27.9 g/（kg·d）]YGJZF灌胃，模型组均予生理盐水15 mL/kg灌胃。分别于实验第6、9周末，模型组随机抽取4只，各中药组均随机抽取6只取材，余大鼠均实验第12周末给药后，禁食，自由饮水12 h后，称体质量乙醚麻醉，经眼眶球后静脉丛采血，常规制备血清，4℃冷藏待检。取血后脱颈处死大鼠，迅速剖取肝脏，肝左叶取体积为1 cm× 1 cm×0.5 cm肝组织，锡纸包裹，放-70℃冰箱待检。

2.3检测方法

1）采用Elisa法检测大鼠血清8-iso-PGF-2α含量；分别采用硫代巴比妥酸比色法（试剂盒）和紫外分光光度法（试剂盒）测定大鼠肝组织匀浆MDA含量、XOD活性。

2）肝组织病理学：肝组织用10%中性缓冲甲醛液固定，石蜡包埋，常规切片。HE染色，光镜下观察肝脏病理改变。肝脏脂肪变性及炎症程度评分参照中国医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的《2010版酒精性肝病诊疗指南》[5]。

2.4统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素的方差分析，组间两两比较时，若方差齐，采用LSD法，若方差不齐，采用Dunnett’s T3法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1大鼠死亡情况 实验结束时，共25只大鼠死亡，其中模型组9只，死亡率为40.9%，中药第3周起灌胃组共死亡8只，第6周起灌胃组共死亡5只，第9周起灌胃组共死亡3只，总死亡率为21.3%，死亡主要是由反复乙醇灌胃后乙醇反流入食道吸入肺部所致，个别因肠胀气。

3.2不同时段血清8-iso-PGF2α含量及肝组织匀浆MDA含量、XOD活性的比较 见表1。

表1 各组血清8-iso-PGF2α含量及肝组织匀浆MDA含量、XOD活性比较（±s）Tab.1 Contents of 8-iso-PGF2α in serum and the activity of MDA，XOD in the hepatic tissue homoqenate（±s）

表1 各组血清8-iso-PGF2α含量及肝组织匀浆MDA含量、XOD活性比较（±s）Tab.1 Contents of 8-iso-PGF2α in serum and the activity of MDA，XOD in the hepatic tissue homoqenate（±s）

注：同时间点与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；同时段12周末时，中药等效剂量组（I组）间：与中药6w组比较，#P＜0.05；同时段12周末时，中药高剂量组（Ⅱ组）间：与中药6 w组比较，△P＜0.05；同时段，灌药时长相等等效剂量（Ⅰ组）与高剂量组（Ⅱ组）间：与等效剂量组（Ⅰ组）相比，▲P＜0.05。

XOD（ng/L） （U/g）模型组 6周末 4 12.50±1.71 1.13±0.16 13.83±2.29中药3 w-Ⅰ组 6 11.09±2.91 0.71±0.17 12.87±2.08中药3 w-Ⅱ组 8 9.49±2.73*▲0.67±0.15* 11.55±2.12*模型组 9周末 4 17.06±1.21 1.73±0.15 17.45±2.09中药6 w-Ⅰ组 4 14.98±1.39* 0.97±0.23* 15.89±3.01*中药6 w-Ⅱ组 5 13.56±1.51* 0.89±0.18* 13.91±2.11*▲模型组 12周末 5 30.17±2.90 2.06±0.48**21.62±3.41**中药3 w-Ⅰ组 7 16.04±2.20* 0.89±0.23* 13.69±2.13*#中药6 w-Ⅰ组 5 16.51±2.34* 0.99±0.32* 16.09±2.56*中药9 w-Ⅰ组 5 22.78±4.41* 1.67±0.56*#17.34±4.12*中药3 w-Ⅱ组 8 13.62±2.62** 0.63±0.34*▲11.40±3.01**▲中药6 w-Ⅱ组 5 15.07±2.51*▲0.67±0.43*▲16.01±1.78*中药9 w-Ⅱ组 6 21.35±4.45*△1.65±0.65* 16.23±4.01*▲组别 时间 动物数8-iso-PGF2α MDA（nmol/mg）

由表1可知，第6、9、12周末,模型组大鼠血清8-iso-PGF2α及肝组织匀浆MDA含量、XOD活性均逐渐升高。与各相应时间段模型组比较：第6周末，中药3 w-Ⅱ组大鼠血清8-iso-PGF2α含量及肝组织匀浆MDA的含量、XOD的活性均明显降低（P＜0.05）；第9周末，中药6w组大鼠血清8-iso-PGF2α含量及肝组织匀浆MDA含量、XOD活性均明显降低（P＜0.05）尤以中药6 w-Ⅱ组更明显；第12周末，中药3、6、9 w各组大鼠血清8-iso-PGF2α及肝组织匀浆MDA含量、XOD活性均明显降低（P＜0.05或P＜0.01），且均以Ⅱ组降低更明显。

同时段第12周末，YGJZF各组组间比较：大鼠血清8-iso-PGF2α含量及肝组织匀浆MDA含量、XOD活性降低程度总体上中药3 w组＞中药6 w组＞中药9 w组，且中药9 w-Ⅰ组大鼠血清8-iso-PGF2α及肝组织匀浆MDA含量与中药6 w-I组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；中药3 w-Ⅱ、9 w-Ⅱ组大鼠血清8-iso-PGF2α含量与中药6 w-Ⅱ组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药3 w-Ⅱ组大鼠血清8-iso-PGF2α含量及肝组织匀浆MDA含量、XOD活性均低于中药3 w-Ⅰ组（P＜0.05）；中药6w-Ⅱ组大鼠血清8-iso-PGF2α含量及肝组织匀浆MDA含量、XOD活性均低于中药6 w-Ⅰ组，尤以大鼠血清8-iso-PGF2α含量及肝组织匀浆MDA含量差异明显（P＜0.05）；中药9 w-Ⅱ组大鼠血清8-iso-PGF2α含量及肝组织匀浆MDA含量、XOD活性均低于中药9 w-I组，尤以肝组织匀浆XOD活性差异明显（P＜0.05）。

3.3不同时段肝组织病理形态学表现

3.3.1肉眼观察 模型组大鼠肝脏色泽较正常肝脏暗淡，表面呈灰黄色或布有白色脂肪斑点，质地偏硬，被膜与周围组织粘连，包膜紧张，边缘钝而厚；中药组大鼠肝脏呈红褐色，质地稍软，被膜与周围组织有轻度粘连，边缘稍钝。

3.3 ．2病理观察 各时段模型组大鼠肝组织的脂肪变呈进行性加重，第6周末时肝组织脂肪变性属F1-F2级（见图1A），中重度水样变性，细胞肿胀较明显，细胞核浓缩深染，肝小叶周边出现少量脂肪变细胞；第9周末时肝组织脂肪变性属F2-F3级（见图1B），伴随水样变性；第12周末时肝组织脂肪变性属F3-4级（见图1C），肝细胞边界不清，细胞核浓缩深染，汇管区炎性细胞浸润，细胞胞质呈现空泡状，肝细胞内出现大小不等的脂滴。第6周末时，中药3 w组肝组织脂肪变性属F1级（见图1D、图1E）：肝组织中度水样变性，较模型组轻，部分点灶状坏死，汇管区可见少量炎细胞浸润，肝小叶周边出现少量脂肪变细胞。第9周末时，中药6 w组肝组织脂肪变性属F2-F3级（见图1F、图1G）：肝组织均出现点灶状坏死，中度水样变性，但较模型组轻。第12周末时，中药3 w组肝组织脂肪变性大部分属F2级（见图1H、图1I），脂肪病变程度较模型组明显减轻；中药6 w组肝组织脂肪变性较模型组损伤程度轻，大部分属F2-F3级，但水样变性较明显（见图1J、图1K）。中药9 w组肝组织脂肪变性较模型组损伤程度轻，大部分属F2-F3级,肝组织出现点灶状坏死，中度水样变性（见图1L、图1M）。且各中药II组病理损伤程度均较中药I组轻。

图1 各组大鼠病理结果（HE×100）Fig.1 Results of pathology in rats of each group（HE×100）

4 讨论

AFLD发病机制复杂，是多因素共同作用的结果，常见机制有乙醇代谢紊乱、线粒体功能障碍、氧化应激、内毒素、营养不良等，研究证实，氧化应激与脂质过氧化在AFLD的发生发展中起重要作用[6-7]。长期饮酒，乙醇在代谢过程中产生过多的氧自由基（ROS），同时伴体内抗氧化物减少，促发氧化应激[8]，引起的生物膜脂质过氧化，导致肝脏脂类堆积[9]。

本研究结合课题组前期临床与实验结果[1]将8-iso-PGF2α与MDA、XOD一同作为评价AFLD氧化应激与脂质过氧化损伤的指标进行观察分析。

8-iso-PGF2α是细胞膜上脂化的花生四烯酸受自由基攻击后裂解而形成的前列腺素衍生物，是评价氧化应激和脂质过氧化反应最有效的特异性标志物[10-12]，目前与肝脏疾病的关系主要集中于肝脏缺氧复氧损伤[13]、创伤性休克继发性肝损伤[13]、酒精性肝硬化[14]、非酒精性脂肪性肝炎[15]等；黄嘌呤氧化酶（XO）主要来自肝脏胞浆中，是一种非特异性需氧脱氢酶，体内核酸代谢中一个重要的酶[16]。90%以相对无活性的前体黄嘌呤脱氢酶（XDH）的形式存在。当组织处于缺血缺氧等病理情况下，XDH可转化为有活性的XO，催化组织中黄嘌呤氧化反应，产生大量的自由基，引发脂质过氧化反应。当肝细胞膜受损时，血清XO释入循环且活性不同程度升高，可作为早期酒精性肝损伤应激性损伤的敏感指标；而丙二醛（MDA）为病理情况下机体形成的一系列脂质过氧化物降解产物之一，可反映脂质过氧化及机体组织和细胞损伤的程度，与肝损伤发生、发展密切相关[17]。

药物预适应是用药物模拟缺血预适应中的介质，使其产生预处理效应，是减轻缺血再灌注损伤保护组织的一种有效方法[18]。目前有关中药在肝脏预适应保护作用中的报道很少，本研究尝试借鉴外科缺血预处理对缺血再灌注损伤保护机制的认识，把预处理的早期效应与延迟作用放大延伸为乙醇不同时段的刺激，诱导实验性SD大鼠的造模，同时以YGJZF方药自3w、6 w、9 w不同阶段的实施干预，观察分析中药复方对实验大鼠氧化应激的影响。

本研究表明乙醇灌胃联合高脂饲喂法可顺利成模，随着实验大鼠脂肪变程度的进行性加重，AFLD大鼠脂质应激损伤指标MDA、XOD、8-iso-PGF2α亦逐渐升高；YGJZF干预后，大鼠各损伤指标较同时段模型组明显降低,且与肝脏病理学损伤变化呈正相关趋势。

综上，随着酒精肝造模的进行SD大鼠脂质过氧化损伤逐渐加重，经中药YGJZF干预后氧化应激指标及病理形态学与模型对照组比较均有程度不同的改善，YGJZF干预可降低各氧化应激指标，并均显示干预愈早、用药浓度愈大，病损改善越明显，呈现出典型的量、时、效关系。降低乙醇诱导SD脂肪肝大鼠氧化应激损伤可能是中药YGJZF改善肝功能及脂质代谢发挥防护效应的重要机制。

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Experimental searches for Yigan Jiangzhi Fang on peroxide damage

ZHAO Yuan-hong1,ZUO Xiao-na2,HAN Su-heng2,XU Yu2,JIA Ying-jie1,LI Zheng1,3
（1.Department of Oncology,The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China；2.Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China；3.Manufacturing Laboratory,The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300385,China）

[Objective]To explore intervention effect of oxidative stress effect for AFLD rats at different times,to analyze antioxygenation of YGJZF to AFLD rats and surgery its possible mechanisms.[Methods]The 97 SD rats were randomized into model group 22 and YGJZF group 75,which were divided into six groups.The model rats were induced by gradient ethanol gavage and high fat feeding method.Alcohol by gavage in half an hour,rats in YGJZF groups were given equivalent and high dose[13.95（g/kg·d）and 27.9（g/kg·d）] of YGJZF since the third,sixth and ninth week respectively,and in model groups normal saline（1.5 mL/kg）,until the end of 12th week,at the end of third,sixth and ninth week,the serum values of ALT,AST,TC,TG,8-iso-PGF2α,and hepatic tissue’change of MDA,XOD and pathological.[Results]Compared with corresponding model groups,at the end of the 6th week,in 3w-Ⅱgroup the level of 8-iso-PGF2α,MDA and XOD reduced obviously（P＜0.05）.At the end of the 9th and 12th week,the level of 8-iso-PGF2α、MDA and XOD reduced obviously（P＜0.05）,particularly in II group.At the end of 12th week,the results in the 3 w group were the best,and in the 9 w group were the worst,the difference between 3w-I,9w-I and 6w-I in TG,8-iso-PGF2α,MDA was remarkable（P＜0.05）;each index in YGJZF-II group was lower in YGJZF-I group,especially the value of 8-iso-PGF2α in 3w group；8-iso-PGF2α and MDA in 6w group; XOD in 9w group（P＜0.05）.At the end of the 6th,9th and 12th week,compared with model groups,the degree of hepatic fatty change alleviated to some extent particularly in II group;and at the end of the 12th week,the change in 3 w group was beater than in 6w group,in the same between the 6w group and 9w group.[Conclusion]This article showed that YGJZF played a role in reducing SD rats’oxidative stress injury caused by alcohol in different periods of intervention,especially when the earlier intervention was done,and restrained pathological injure of AFLD rats presenting time and concentration dependence to some extent,which provided the experimental basis for the chooses of medication and time in the prevention and control of AFLD in clinic.

Yigan Jiangzhi Fang;alcoholic fatty liver disease;oxidative stress;pretreatment;pathology

R572.2

A

1672-1519（2014）12-0743-05

2014－05－25）

（本文编辑：马 英，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.12.13

天津市应用基础及前沿技术重点项目（11JCZDJC11900）。

赵远红（1963-），女，主任医师，硕士生导师，长期从事脾胃、肝胆系统的中医临床、教学与基础研究。

李 正，E-mail:lizheng@shitian.com。

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