刘树业

专家述评

肝癌诊断相关标志物的应用

刘树业

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，存活率低，早期诊断面临挑战。随着对肝癌生物学的了解和检验技术的进步，从病理学、基因学及分子生物学等方面研究肝癌的发生发展过程，进而发现大量的潜在标志物，这些标志物有利于早期诊断、最佳治疗、降低肿瘤复发及外科手术或者肝移植后的肿瘤转移。本文将相关标志物做一个总结。

肝癌；细胞因子；miRNA；早期诊断；侵袭转移；预后

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内，HCC在恶性肿瘤中位列第五，病死率位列第三。每年有626 000新患病例，600 000死亡病例，患病率与病死率基本持平，早期明确诊断和正确治疗是影响预后的关键。随着对HCC生物学的了解和技术进步，从病理学、基因学及分子生物学等方面研究HCC的发生发展过程，进而发现大量的生物标志物有利于早期诊断、最佳治疗、降低肿瘤复发及术后肿瘤转移。

理想的肿瘤标志物需要有较高的特异性，能够将HCC与肝硬化、肝炎、肝脏再生结节等区别开来；同时还需要较高的敏感性，能够在HCC早期提示诊断，且具有易检测、可重复、侵入少的特点。目前用于诊断HCC的标志物有甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、甲胎蛋白异质体L3（alpha-fetoprotein L3，AFP-L3）、DES-羧基凝血酶原（DES-carboxyl prothrombin，DCP）、磷脂酰基醇蛋白聚糖-3（glypican-3，GPC-3）、γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyl transferase，GGT）、a-L-岩藻糖苷酶（a-L-fucosidase，AFU）、人羰基还原酶2、高尔基体蛋白酶73（golgiprotease，GP73）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、肿瘤特异性生长因子（tumor specific growth factor，TSGF）、微小RNA（microRNA，miRNA）等。本文对上述标志物在HCC诊断中的应用进行总结探讨。

1 蛋白质及酶类

1.1 AFP-L3最早被发现并应用于诊断HCC患者和临床治疗效果及疾病进程跟踪的标志物是AFP，到目前为止，依然被认定为诊断HCC的金标准。AFP血清浓度持续大于500 ng／mL时即可诊断为HCC。低于500 ng／mL且在血液中非持续存在则经常被认为是良性肝脏疾病。如果患者存在HCC危险因素（比如肝硬化），那么AFP水平持续增高，就有可能发展成HCC。但是，血清AFP的敏感性（40%～65%）和特异性（76%～96%）均不佳，并且不能预测HCC的大小、分期或疾病进程情况，在临床应用上有一定的不足之处。1989年AFP-L3被Taketa发现，AFP-L3含有AFP的扁豆凝集素结合部分，为HCC细胞特有。AFP-L3相对于AFP具有更高特异性及HCC阳性预测值，而且AFP-L3值与总AFP值无相关性，是独立于总AFP值的HCC诊断因子［1］。另外，AFP-L3与肝功能不佳、肿瘤低分化程度及生物学恶性行为相关。

1.2 DCP DCP为异常的凝血酶原蛋白，可以在HCC患者或维生素K缺乏及服用华法林的患者血清中检测到。DCP诊断HCC的灵敏度在48%～62%之间，特异性在82%～98%之间（以酶联免疫法测定，40mAU／mL为DCP临界值）［2］。DCP和AFP之间没有明显的相关性，其与HCC的肝内转移尤其是门脉转移相关［3，4］。因此，DCP在HCC预后评估方面优于AFP，但并没有体现出早期诊断的优势。但在区别HCC和非恶性肝脏肿瘤以及监测小细胞肝癌方面均优于AFP［5］。通过表1可以看出诊断HCC的灵敏度和特异性，AFP-L3与DCP联合检测的准确性优于AFP［1-3］。

1.3 GPC-3 GPC-3在胎儿时期的肝脏高表达，出生后异常表达与肿瘤发生发展关系密切，在HCC中GPC-3呈高表达，而在其他肿瘤或良性肝病中呈低表达或中度表达［6］。目前，GPC-3诊断癌前病变及早期HCC具有较高的敏感性及特异性［7，8］，与AFP联合诊断可以提高早期HCC的诊断率，为HCC患者取得早期治疗时机。GPC-3在HCC中高表达这一特性除了用于诊断外还用于HCC的靶向治疗，甚至疫苗研究［9］。目前，多数研究集中于GPC-3在HCC中的作用机制。另外，GPC-3的免疫治疗文献报道较多，但大多仅是动物实验，临床实验较少，要使GPC-3免疫治疗有更进一步发展，必须要有更多的临床实验支持。

表1 HCC血清标志物的诊断价值（%）

1.4 GP73 GP73又称高尔基体磷酸化蛋白，大样本临床研究［10］证明，GP73可作为恶性肝病的独立指标与AFP互补应用于临床。监测丙型肝炎患者血清中GP73水平可预测HCC的发生［11］。同时，HCC组织中GP73的表达与肿瘤大小、血管侵犯等呈正相关［12］。一项对亚洲人群的研究［13］显示，GP73作为诊断HCC的血清标志物更适用于中国人群。

1.5 其他其他酶学指标如AFU、GGT、碱性磷酸酶，广泛分布于人体正常组织、血液、体液中。这些指标在HCC患者血清中升高，但是检测时标本的存放时间会影响其测定的结果，而且并不是HCC的特异性诊断标志物，联合检测可以作为AFP的有效补充［14］。

总的来说，AFP、AFP-L3、DCP、GPC-3、GGT、AFU、GP73都用于HCC早期诊断。近年临床实验研究的热点集中在优化组合上。目前的研究中，指标搭配形式较多，每项组合中都有AFP或AFP-L3。从灵敏度和特异性综合考虑来看，现有研究比较公认的组合有AFP-L3＋DCP、GP73＋AFP-L3以及GPC-3＋AFP。但是尚未有研究对以上标志物做综合分析，哪些指标组合更利于临床诊断有待进一步研究。

2 细胞因子类

相对于蛋白及酶类对HCC早期的诊断作用，细胞因子及其受体类则侧重于肿瘤的侵袭转移、靶标治疗、预后。与HCC密切相关的生长因子及受体有TGF-β1、HGF、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、TSGF、EGFR、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）、胰岛素样生长因子-Ⅱ等。

2.1 TGF-β1 TGF是具有生物活性的多肽，在肝细胞增殖中起负相调节作用，可使肝细胞逃避TGF-β1介导的生长抑制效应［15］。有研究［16］发现HCC患者TGF-β1水平显著高于良性肝病患者。HCC诱癌模型的动态观察研究［17］发现，TGF-β1及TGF-β1mRNA表达呈渐进型梯度增加，增加血管生成促进进展期肿瘤生长、侵袭与转移［17］。

2.2 HGF HGF由胚胎发育和肝脏再生过程中产生，与癌细胞表面c-Met受体结合能引起基质金属蛋白酶表达增加，从而引起细胞外基质的降解，促进癌细胞的转移和侵袭，并且导致癌转移和降低患者生存期［18］。电镜下HGF定位于癌细胞的滑面内质网，其表达与癌细胞分化程度间无相关性。术后HGF水平高者，预后相对差。慢性肝炎、肝硬化和HCC患者血清中HGF水平反映HCC的发生状态，故HGF表达可作为HCC诊断的一个指标［19］。

2.3 VEGF肝VEGF主要存在于肝细胞，其内皮细胞中有VEGF受体。癌组织VEGF表达明显升高，启动了新生血管生长，血管形成是HCC生长、侵袭和转移的基础，新生血管提供营养，排除代谢产物，也是肝癌细胞播散的途径［20］。VEGF除促进血管增殖外，还能增加血管通透性，其强度是组织胺的数百倍。HCC早期VEGF过表达，可引起血中VEGF增加，表现为HCC患者血清VEGF水平明显高于慢性肝炎和肝硬化患者，反映HCC早期新生血管形成。

2.4 TSGF TSGF由肿瘤细胞在其生长期释放入周边血液中，在诊断HCC中的敏感性可以达到82%，同时检测TSGF（cutoff值65 U／mL），AFP（cutoff值25 ng／mL）及血清铁蛋白（cutoff值240 ng／mL）三个指标，灵敏度和特异性分别能达到98.4%和99%［15］。

EGFR和bFGF与HCC术后早期复发和降低无病生存期有关，HCC患者的血清EGFR和bFGF水平显著高于肝转移癌、肝硬化及肝良性病变患者［21，22］。这些细胞因子可用于HCC的早期诊断或监测其复发情况，但由于其在血清中稳定性差，因此临床应用受到一定的限制。

3 miRNA

miRNA是内源性短的非编码RNA，一般由20～25个碱基组成。研究［23］发现，循环miRNA能稳定存在，这些游离的miRNA不但能抵抗RNA酶的消化，且可耐受高、低pH值、反复冻融、长期储存等复杂环境，这些特征使循环miRNA可能成为一种新的肿瘤分子标志物。表2对目前文献［24-36］报道的有关HCC循环miRNA的研究进行了总结，可见miRNA在HCC的筛查、诊断、监测治疗和预后评估方面均有很好地临床价值。虽然HCC循环miRNA的研究取得了进展，但也存在一些亟待解决的问题，例如目前没有公认的内参照miRNA，许多研究采用不同的内参照或加入非人源性miRNA作为外参照，导致各研究间的数据兼容性和可比性差；各研究采用的血液样本（血清或血浆）也不尽相同。另外，有研究［37］发现许多因素可导致实验结果偏倚，即便是轻微的溶血亦可导致游离miRNA浓度改变，因此采血流程需标准化才能够保证miRNA检测的准确性。

4 小结

随着对HCC生物学的了解和技术进步，大量诊断HCC的标志物被研究并报道出来，如何选择最有利于临床实践的标志物变得富有挑战性。本文集中讨论了最广泛应用和最易接受的生物标志物。尽管存在局限性，血清AFP依然是临床应用最广泛的肿瘤标志物。AFP-L3和DCP联合检测在鉴别HCC和肝脏良性肿瘤及检测小肝癌方面优于单纯AFP检测。另外，其他肿瘤标志物，比如GPC-3、GGT、AFU都是AFP-L3和DCP检测HCC的有益补充。细胞因子类也可用在HCC的早期诊断，然而更加倾向于判断HCC的侵袭、预后及复发情况。

表2 HCC循环miRNA

最新发现的肿瘤分子标志物miRNA家族的前景最好。miRNA家族在HCC中异常表达，其中一些在癌变过程中发挥作用。另外，某些miRNA已经被证实与HCC或HCC亚型相关，就有可能用于HCC分期诊断及预后。那么就有可能建立一个平台，进行HCC诊断、风险评估、患者危险因素分级等，最终达到个性化治疗的目的，为临床服务。

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2014-11-09）

（本文编辑：杨军）

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