申伟霞，田巧珍，陈 圆，胡 涛，闫丽萍，李国新，李雪松，滕巧泱，赵宇军，李泽君

（1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801; 2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法的建立及初步应用

申伟霞1,2，田巧珍2，陈 圆2，胡 涛2，闫丽萍2，李国新2，李雪松2，滕巧泱2，赵宇军1，李泽君2

（1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801; 2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

虽然H3、H9亚型禽流感病毒（Avian inf uenza virus, AIV）是低致病性禽流感病毒，但其具有跨宿主感染哺乳动物的能力，对社会公共卫生安全具有重大的潜在危害，因而对这些亚型病毒的监测极其重要。通过比对GenBank上H3、H9亚型禽流感病毒HA基因序列，设计了分别针对H3 AIV和H9 AIV的特异性探针。特异性试验和标准曲线试验的结果显示，这两个探针仅分别特异性识别H3、H9亚型AIV，且具有较好的扩增效率。通过重组质粒pMD19-T-H3HA和pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板，进行敏感性实验。结果表明，本研究所建立的荧光定量PCR方法能检测到100个DNA拷贝数H3 AIV和10个DNA拷贝数的H9 AIV，比传统PCR方法敏感性分别提高了100倍和1000倍。此外，本方法还能检测到10 EID50的H3亚型AIV或H9亚型AIV，比传统PCR方法检测敏感性均提高了1000倍。批间和批内试验的变异系数均小于3%，表明本研究建立的方法具有较好的重复性。此外，与传统PCR方法相比，用H3、H9亚型AIV双重荧光定量PCR方法检测人工感染动物的肺组织时，针对H3 AIV的敏感性提高了10～100倍，针对H9 AIV的敏感性提高了100倍。综上所述，本研究所建立的H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法具有较高的特异性和敏感性，对H3、H9亚型禽流感病毒监测具有重要的应用价值。……