陈霄峰 陈文芬 林明增 罗文达

bcr/abl阴性表达的骨髓增殖性肿瘤患者JAK2V617F基因突变的临床研究

陈霄峰 陈文芬 林明增 罗文达

目的 探讨JAK2V617F基因突变在bcr/abl阴性表达的骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中的发生率及临床意义。方法应用实时荧光PCR法检测99例bcr/abl阴性表达的MPN患者的JAK2V617F基因突变。结果99例患者中发现70例（70．7%）JAK2V617F基因突变，其中真性红细胞增多症（PV）中突变发生率90．6%（29/32），原发性血小板增多症（ET）中突变发生率62．5%（15/24），慢性特发性骨髓纤维化（CIMF）中突变发生率60．9%（14/23），骨髓增殖性肿瘤未分型（MPN-U）中突变发生率为60．0%（12/20）。PV患者的突变率高于ET、CIMF及MPN-U（P＜0．05或0．01）。JAK2V617F基因突变型患者的年龄大于野生型患者（P＜0．01），血白细胞计数和血红蛋白水平高于野生型患者（P＜0．05或0．01）。结论bcr/abl阴性的MPN患者JAK2V617F基因突变发生率与疾病类型、年龄、外周血细胞计数相关，可以作为bcr/abl阴性MPN患者主要的分子遗传学异常标志，有助于临床诊断。

骨髓增殖性肿瘤 JAK2V617F基因突变 实时荧光PCR

骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferativeneoplasms，MPN），既往称骨髓增殖性疾病（myeloproliferative disorders，MPD），是一类起源于多能造血干细胞，以一系或多系分化相对成熟的骨髓细胞克隆性增殖异常为特点的一组异质性疾病。按WHO分类，包括慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）、真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocytosis，ET）、慢性特发性骨髓纤维化（chronic idiopathic myelofibrosis，CIMF）和骨髓增殖性肿瘤未分型（MPN unclassified，MPN-U）等。2005年James等[1]发现部分MPN患者存在的JAK2基因突变，对MPN的诊断和发病机制的研究等产生了重要影响。近年来笔者检测了 99例 bcr/abl阴性表达的 MPN患者的JAK2V617F基因突变情况，并结合临床进一步分析以探讨其临床意义，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 2010-01—2014-04本院门诊及住院初诊为MPN的患者共99例（MPN组）。其中男54例，女45例，年龄25～85岁，平均（53.6±8.4）岁，中位年龄52岁。按照2001年WHO分型诊断标准[2]，PV 32例、ET 24例、CIMF 23例、MPN-U 20例。对照组20例为本院健康体检者，其中男11例，女9例，平均（52.3±7.1）岁。两组间年龄及性别比较均无统计学差异（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 抽取受试者骨髓或外周血3ml，EDTA抗凝，标本送检至杭州艾迪康医学检验中心，以DNA抽提试剂盒（北京天根生化科技有限公司产品），抽提基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行，根据分光计测量浓度并确定纯度后，DNA终浓度调节为200ng/μl。

1.2.2 JAK2V617F基因突变检测 采用实时荧光PCR法检测（ABL 7500），引物由艾迪康医学检验中心自行设计，于TAKARA公司合成，正义引物1条，反义引物1条，野生型和突变型探针各1条由上海基康公司合成。PCR反应体系为：使用TOYOBO THUNDERBIRD qPCR Mix成品试剂盒，模板2μl，按试剂盒要求加入PCR扩增体系，反应条件为：95℃预变性1min；95℃10s，60℃1min，共45个循环，60℃1min采集荧光信号，阳性对照使用阳性质粒，空白对照使用双蒸水，扩增后直接使用荧光PCR分析软件分析检测结果。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，计数资料多组间比较先用行×列表的χ2检验，再行两两比较。

2 结果

2.1 JAK2V617F基因实时荧光PCR检测结果 见图1。

图1 JAK2V617F基因实时荧光PCR检测结果示意图[纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环参数（CT）值。纯合突变指只有一种突变基因型的样本，杂合突变就是既有突变型又有野生型存在的样本。JAK2V617F基因突变阳性即为JAK2V617F杂合突变或纯合突变（突变型），JAK2V617F基因突变阴性即为JAK2V617F未突变（野生型）]

2.2 JAK2V617F基因突变与患者临床特征的关系 99例MPN患者中JAK2V617F基因突变阳性共70例。PV、ET、CIMF和MPN-U患者中JAK2V617F基因突变发生率分别为90.6%、62.5%、60.9%和60.0%，对照组未检出突变。PV组分别与ET、CIMF、MPN-U组比较，突变发生率均有统计学差异（P＜0.05或0.01），但ET、CIMF和MPN-U 3组间比较，突变发生率无统计学差异（χ2=0.67，P＞0.05）。

JAK2V617F基因突变型患者平均年龄大于野生型患者[（57.5±8.4）岁vs（43.2±4.8）岁，t=5.81，P＜0.01]，在PV、ET和MPN-U组中，基因突变型患者的平均年龄均高于野生型（均P＜0.05），而CIMF组中基因突变型患者与野生型患者的年龄无统计学差异（P＞0.05）。JAK2V617F基因突变在男性发生率为70.4%，女性发生率为71.1%，两者间比较无统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 JAK2V617F基因突变与患者临床特征关系

2.3 JAK2V617F基因突变与患者外周血细胞计数的关系 JAK2V617F基因突变型患者的白细胞计数和血红蛋白水平在MPN各组中均高于野生型患者（P＜0.05或0.01），但血小板计数无统计学差异（P＞0.05），见表2。

表2 JAK2V617F基因突变与患者外周血细胞计数间的关系

3 讨论

JAK2是定位于9号染色体短臂2区4带（9p24）的胞内酪氨酸蛋白激酶（PTK），由7个高度同源结构域JH1～JH7构成，与JAK1、JAK3、TYK2同属于Janus激酶家族[3]。2005年James等[1]率先在PV患者发现JAK2突变，以后多个研究小组均报道了JAK2V617F的突变。正常情况下，JH2区域有自我抑制JAK2酪氨酸激酶活性的功能，只有在造血细胞生长因子信号刺激下才使造血细胞增殖分化。所谓JAK2V617F突变指的是JAK2的12号外显子中1 849位核苷酸G→T突变，导致JAK2蛋白激酶样区结构域（JH2）617位的缬氨酸错义编码为苯丙氨酸[4]，进而解除了JH2区域的自我抑制功能，激活JAK2的表达。JAK2的持续活化，通过JAK-STAT通路传导至细胞核内，促进相关基因活化，如红系祖细胞的细胞生存蛋白bcl-x过度表达及红系祖细胞凋亡减少，或促进造血细胞系的G1/S期活化，伴细胞周期蛋白D上调和抑制因子p27下调等，使血细胞大量增殖[1，4]。本文结果显示，在MPN患者中JAK2V617F基因突变发生率为70.7%，其中PV、ET、CIMF、MPN-U 4组JAK2V617F基因突变发生率分别为90.6%、62.5%、60.9%、60.0%，与国内外报道一致[5-6]，对照组则未发现突变病例。PV患者的突变发生率高于ET、CIMF及MPN-U，但后3者突变发生率无统计学差异。2008年，WHO将JAK2V617F列入bcr/abl阴性的PV、ET、CIMF的诊断依据中，揭示了此基因的重要性，亦为临床诊断提供了一个重要的依据，本文结果也较好揭示了这一点。2008年WHO诊断标准中，由于JAK2V617F基因检测的出现，血红蛋白及血小板计数较以往规定的指标值有所下降。如果JAK2突变阳性，血红蛋白升高（男性＞185g/L，女性＞165g/L）及骨髓红系细胞增生明显即可诊断PV。即使血红蛋白低于以往WHO规定的指标值，但持续超过正常值20g/L，也可确诊为PV。而对于ET，只要具备JAK2突变阳性，血小板持续＞450×109/L及骨髓巨核细胞增生，即可诊断。所以在临床上，如果JAK2突变阳性，则可以排除反应性红细胞增多或血小板增多症。但需注意一部分患者JAK2突变为阴性，需动态观察及注意检测方法的选择。

JAK2V617F基因突变的检测方法有直接测序法、PCR技术等。本研究中应用实时荧光PCR法检测，优点为特异性强，自动化程度高。JAK2V617F突变存在纯合和杂合两种类型，James等[1]认为，JAK2V617F突变对MPN的发生并非必要，在出现临床症状后，突变只是作为一个基因事件与疾病的进展相关，据此JAK2V617F突变阴性的MPN患者应处于疾病早期阶段，若为纯合型JAK2V617F突变患者则病程最长，疾病处于较晚期阶段，杂合型向纯合型转变过程代表着疾病进展[7]。故对突变阴性患者可定期复查JAK2V617F基因突变情况。

本研究还发现JAK2V617F基因突变型患者的平均年龄高于野生型，但突变发生率在不同性别比较无统计学差异。Carobbio等[8]报道JAK2V617F基因突变型患者的平均年龄高于野生型，并认为患者年龄＞60岁是影响患者存活时间的不利因素，本文结果与此报道基本相符。Tefferi[3]认为血白细胞增多对于PV和ET患者的总体生存期及PV的白血病转化都有着重要的预后价值。在本研究中，JAK2V617F突变阳性者，表现为血白细胞增高，与野生型比较有统计学差异，其表达与预后的关系有待进一步追踪观察。国内晁红颖等[9]报道JAK2V617F基因突变型患者的血白细胞计数和血红蛋白水平高于野生型患者，但血小板计数无差异。本文报道与此相符，但其相关性需更大样本来证实。

JAK2V617F基因突变的发现将给MPN靶向治疗药物的研制带来新的方向，如Werning等[10]的研究报道JAK2抑制剂有良好的作用。

综上所述，JAK2V617F基因突变检测开展可提高MPN的临床诊断水平，尤其对早期或不典型的MPN诊断具有重要意义，亦为靶向治疗提供了一个很好的思路。

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JAK2V617F gene mutation in patients with bcr/abl-negative myeloproliferative neoplasms

Objective To investigate the frequency and clinical implication of JAK2V617F gene mutation in patients with bcr/abl-negative myeloproliferative neoplasms(MPN)．MethodsJAK2V617F mutation was screened by real-time fluorescent PCR in 99 patients with bcr/abl-negative MPN．ResultsJAK2V617F mutation was detected in 70 of 99 patients with MPN,the frequency rate of mutation was 90．6%(29/32)in patients with polycythemia vera(PV),62．5%(15/24)in essential thrombocythemia (ET),60．9%(14/23)in chronic idiopathic myelofibrosis(CIMF)and 60．0%(12/20)in myeloproliferative neoplasma-undifferentiated (MPN-U)．The frequency of JAK2V617F mutation in PV patients was significantly higher than that in ET,CIMF,and MPN-U patients(P＜0．05 or 0．01)．There were significant differences in age,leukocyte counts,and hemoglobin levels between JAK2V617F positive and negative patients(P＜0．05 or 0．01)．ConclusionJAK2V617F gene mutation is correlated with the classification of MPN,age and blood cells counts．It may be used as a molecular marker for patients with bcr/abl negative MPN．

Myeloproliferative neoplasms JAK2V617F mutation Real-time fluorescent PCR

2014-04-28）

（本文编辑：胥昀）

318050 浙江省台州恩泽医疗中心（集团）路桥医院血液科