卢亚玲，王小楠，刘文杰 *，贾清华，芦倩雯

（1.塔里木大学 生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；3.塔里木大学分析测试中心，新疆 阿拉尔 843300）

啤酒花（Humulus lupulusL.）又名忽布（hop）、香蛇麻花、酒花、野酒花，为桑科草属多年生攀缘草本植物[1]，酒花品种很多，分为苦味型和香味型两种。酒花为贵重的特用经济作物，是酿造啤酒的重要原料。酒花中的主要成分能赋予啤酒柔和优美的芳香和爽口的微苦味，能加速麦汁中高分子蛋白的絮凝，提高啤酒泡沫的起泡性和泡持性，也能增加啤酒的生物稳定性，是酿造啤酒不可缺少的物质[2-3]。目前，酒花中已检测出数百种组成不同的有机化合物，其风味特征是由一组化合物之间既独立又相互协同而产生的[4]。而酒花中的挥发性和半挥发性成分对其风味影响较大。

新疆具有啤酒花生长得天独厚的自然条件，新疆啤酒花种植区域和种植品种较多，是世界三大啤酒花种植基地之一，种植面积和产量位居全国第一[5]。由于新疆的特殊气候环境，新疆产地酒花在品种和质量上也具有明显的地域特征。

对于酒花及其产品中挥发性成分的分析，常用的萃取方法有水蒸气蒸馏法、挥发油提取器提取法、连续液-液提取技术[6]、固相微萃取法等[7-9]，由于固相微萃取操作简单、时间短、样品量少，适用于挥发性有机物、半挥发性有机物及不具挥发性的有机物，可以随身携带，现场采集，并可在气相色谱仪器上直接进样，提高了分析速度和检测灵敏度[10-11]，采用固相微萃取方法萃取挥发性组分成为发展趋势。因此，研究通过与挥发油提取器提取法比较，采用顶空-固相微萃取法-气相色谱-质谱联用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography mass spectromeyry，HS-SPME-GC-MS）分析新疆产地啤酒花中的挥发性成分，由于酒花品种不同、产地的差异，挥发性组分的含量差别较大，因而采用SPSS软件进行聚类分析，以期为新疆酒花质量的控制提供更好的依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆青岛大花（苦花，样品7）、扎一颗粒啤酒花（样品6）、马可波罗颗粒啤酒花（样品5）：新疆绿宝酒花有限公司；样品1，2，3，4，8为采摘于昌吉、塔城及库尔勒的啤酒花样品。

无水硫酸钠、无水乙醚均为分析纯：天津市致远化学试剂有限公司；Millipore超纯水：美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

Finnigan Trace GC-DSQ气相色谱-质谱联用仪（配置电子电离源）：美国Thermo Fisher公司；BB89-2000挥发油提取器：北京中西远大科技有限公司；VIC-412电子分析天平：北京赛多利斯仪器有限公司；SPE-12固相微萃取装置：美国Superlco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 GC-MS联用条件

Finnigan Trace GC-DSQ气相色谱-质谱联用仪；色谱柱：DB-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）检索谱库：NIST、Replib、Mainlib。

色谱条件：起始柱温40 ℃保持2 min，以5.5 ℃/min升温至100 ℃保持1 min，以3.5 ℃/min升至120 ℃保持4 min，以2 ℃/min升至160 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升温至230 ℃保持5 min。载气为He，流速1.2 mL/min，分流比1∶10，进样口温度220 ℃，传输线温度250 ℃。质谱条件：离子源温度220 ℃，电离方式为电子电离（electron ionization，EI），电子能量70 eV，扫描范围50～400 amu。

1.3.2 固相微萃取方法

啤酒花样品，于-20 ℃密封储藏于冰箱中，使用前取出粉碎。用于提取方法比较的为苦花型青岛大花。

采用静态顶空固相微萃取法，准确称取0.15 g样品，置于4 mL顶空样品瓶中，于70 ℃恒温水浴中预热5 min，吸附30 min。萃取完毕后，进气相色谱-质谱仪分析，萃取头在220 ℃解析5 min。

1.3.3 挥发油提取器提取条件

称取粉末样品25 g，加入1 L水，连接挥发油提取器，提取4 h，直至无油分流出。收集挥发油成分，加无水硫酸钠干燥，加乙醚定容至15 mL。

2 结果与分析

2.1 两种提取方法的比较

以固相微萃取与挥发油提取器提取样品进行比较，通过比较发现挥发油提取器提取的目标物较少，而固相微萃取可以萃取得到更多的目标物峰。而且由于挥发油提取需要消耗较大的样品量，提取效率也不够高，因此，实验采用固相微萃取法萃取挥发性成分。

2.2 SPME萃取条件的选择

为了确定SPME的最佳萃取条件，分别考察了不同萃取纤维、萃取温度和萃取时间、萃取样品量对测定结果的影响。以苦花样品中的挥发性组分α-蒎烯、2-十一酮，α-古巴烯，2-十二酮，β-石竹烯，α-石竹烯，γ-依兰油烯，γ-杜松烯八种物质的峰面积被用来确定最佳萃取条件。

2.2.1 萃取方式的选择

准确称取0.1 g样品，采用100 μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、75 μm CAR/PDMS、65 μm CW/DVB、30 μm PDMS萃取纤维头，在60 ℃萃取30 min进行比较，由图1可知，100 μm PDMS纤维对这8种化合物的萃取效果更好，65 μm CW/DVB的萃取效果较好。而75 μm CAR/PDMS由于适合萃取极性物质，很多物质未萃取出来。因此，进一步分析均采用100 μm PDMS纤维萃取。

图1 不同萃取纤维对峰面积响应值的影响Fig.1 Effect of different fiber on peak area response values

2.2.2 萃取温度和萃取时间的选择

萃取温度和萃取时间是影响萃取速度和效率的重要因素[9]。高温、长时间有利于HS-SPME萃取，但温度太高、时间太长又会降低萃取头的吸附能力。

图2 不同萃取温度对峰面积响应值的影响Fig.2 Effect of different extraction temperature on peak area response values

萃取温度的选择：准确称取0.1 g样品，利用100 μm PDMS纤维，在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃条件下萃取30 min，进行选择最佳萃取温度。结果见图2。由图2可知，随着温度的升高，选取的目标物的响应峰面积普遍增大，在70 ℃的萃取效果较好，温度过高不利于操作进行。

萃取时间的选择：准确称取0.1 g样品，利用100 μm PDMS纤维，在70 ℃分别萃取5 min、10 min、20 min、25 min、30 min、40 min，结果见图3。由图3可知，萃取时间为30 min时，选取的目标物响应都较高。

图3 不同萃取时间对峰面积响应值的影响Fig.3 Effect of different extraction time on peak area response values

2.2.3 不同样品量的选择

不同的样品量影响萃取头的萃取体积，对萃取效率的影响非常重要。分别准确称取0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g样品，在优化的萃取条件下进行比较，结果见图4。由图4可知，当样品量为0.15 g时，各选取的目标物响应都较好。

图4 不同样品量对峰面积响应值的影响Fig.4 Effect of different sample loading on peak area response values

因此，在优化的色谱条件下，选取样品量为0.15 g，萃取温度为70 ℃，萃取时间为30 min作为啤酒花样品挥发性组分分析的条件。

2.3 固相微萃取-气质联用仪分析结果

在优化的气相色谱-质谱条件下，可以分离出100多种成分，经计算机检索谱库及人工分析质谱图，并参阅有关文献[12-14]能准确鉴定出57种物质。啤酒花油的主要成分为萜烯类化合物，占总酒花油的61.10%，如α-石竹烯、α-蒎烯；其次酯类化合物15种，占总酒花油的15.25%，如丁酸叶醇酯、丙酸叶醇酯、其次为醇类，占挥发油总量的3.95%；此外，还有少量的酮类、酮酸类、萜烯环氧化合物等。

2.4 聚类分析与判别分析

图5为样品中8种目标物的含量图。以所测酒花中的8种目标物为变量，分别对8种产地的酒花进行聚类分析，结果见图6和图7。其中，样品5为马可波罗颗粒酒花，样品6为扎一颗粒啤酒花，样品7为青岛大花，其他为采摘样品。对选取的不同啤酒花品种进行聚类分析，聚类分析是根据试验数据本身所有的定量或定性的特征对大量数据进行分组归类以清楚数据集内在结构，同时对每一个数据集进行描述过程的一种方法[15-16]。

图5 酒花中8种目标物的含量Fig.5 The content of 8 kinds of compounds in hops

图6 聚类分析树状图Fig.6 Dendrogram of cluster analysis

由图5可知，样品啤酒花中，α-葎草烯含量较高，其次是β-石竹烯，其他主要物质含量相当。由图6、图7可知，样品2与样品6归为第1类，样品7与样品8归为第2类，样品3、4、5、1归为第3类。三个组中心也就是聚类分析后得到的三种类别。

区别苦花型酒花与香花型酒花的主要因素是月桂烯（香叶烯）的含量，另一个区别是葎草烯与石竹烯的比值，香花型酒花的比值较高。苦型酒花与香型酒花具有明显的区别，各物质的含量有着明显的差距。因此依据判断，样品7即新疆青岛大花为苦花型啤酒花，样品5马可波罗颗粒为另一类苦花型啤酒花，样品6扎一颗粒为香花型啤酒花，与实际符合，且能很好的判定其他几种采摘酒花的品种和类型，得出样品2为香型酒花，样品1、3、4、8为苦型酒花。

图7 Fisher非标准化典型判别分组图Fig.7 Fisher typical non-standard discriminant group figure

3 结论

通过与挥发油提取器提取方法的比较，采用顶空固相微萃取-气质联用技术（HS-SPME-GC-MS）分析新疆产地啤酒花及颗粒花中的挥发性成分。获得固相微萃取的最佳提取条件为：100 μm PDMS萃取纤维、萃取时间30 min，萃取温度70 ℃，萃取样品量0.15 g。在最优萃取条件下对不同产地、不同品种的酒花进行了聚类分析和判别分析，对不同酒花中挥发性成分的组成进行了归类。所得结果可靠，能有效的为啤酒花品种和品质的鉴定提供依据，有利于对新疆酒花产业的进一步发展。

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