陈其钢，沈艾彬，陈国辉*

（新疆中亚食品研发中心（有限公司），新疆 乌鲁木齐 830026）

红树莓（Rubus idaeus）是蔷薇科悬钩子属植物，多年生小灌木浆果类果树，树莓果属聚合果，形状如宝石，果实鲜嫩多汁，口味酸甜，香味浓，可食率达100%[1]。其营养丰富，维生素A达130 IU，是苹果的13倍[2]；维生素C含量为26～40 mg/100 g，是苹果、葡萄等果实的5～8倍[3]；还含有多种氨基酸、微量元素、花色苷、花青素以及儿茶酸等多酚类物质[4]，红树莓鲜果的营养成分见表1[5-8]。

新疆地处大陆中纬度，气候温和，热量适中，空气湿润，得天独厚的山地气候适宜树莓的生长[9]。红树莓中富含丰富的花色苷，是其主要的呈色物质，随着人类对健康饮食的重视以及科技的发展，对天然色素的需求量将日趋增加，刘建华等[10]研究表明，红树莓花色苷具有较强的清除自由基、抗肿瘤及降脂等多项功能。本研究以新疆南山水溪沟产红树莓为原料提取花色苷，在单因素研究的基础上，采用Design Expert 8.0软件优化提取工艺，为新疆树莓中花色苷的安全有效生产提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜红树莓：新疆乌鲁木齐市南山水溪沟新康种植基地。

盐酸、质量分数30%的双氧水、抗坏血酸、体积分数95%的乙醇、乙酸、三氯乙酸：天津市科密欧化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AB104-N电子天平：Mettle-Toledo公司；UV-2000紫外分光光度计：安捷伦科技有限公司；RE-52B旋转蒸发仪：上海皖宁精密科学仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：上海森信实验仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 树莓花色苷的提取工艺流程

红树莓→研磨→水浴提取→过滤→真空浓缩→冷冻干燥→红树莓花色苷粗提取物

操作要点：新鲜红树莓在组织捣碎机破碎成浆，按一定料液比加入经盐酸酸化的体积分数80%的乙醇溶液，在一定温度的水浴中提取红树莓中花色苷，浸提液经过40 ℃真空浓缩后，于-18 ℃条件下冷冻干燥，得到红树莓中花色苷粗提物。

1.3.2 树莓花色苷含量的检测方法

波长的确定：将解冻后的红树莓研磨，准确称量5.0 g匀浆，加入40 mL经盐酸酸化体积分数80%的乙醇溶液（pH 3），50 ℃水浴浸提1 h，过滤去除滤渣。在波长400～800 nm范围内扫描，确定树莓花色苷最大吸收波长。

花色苷含量的计算根据比尔定律，结合FULEKI T等[11]的研究，得出花色苷含量计算公式：

式中：A0、A1分别为pH 1.0、pH 4.5时花色苷在波长500 nm 处的吸光度值；V为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；M为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的相对分子质量449；ε为Cy-3-Glu 的消光系数29 600；m为样品质量，g。

1.3.3 提取树莓花色苷的单因素试验

料液比对树莓花色苷提取量的影响：将解冻后的红树莓研磨，准确称量5.0 g匀浆，分别按1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g∶mL）加入经盐酸酸化的体积分数80%的乙醇溶液（pH 3），50 ℃水浴浸提1 h，过滤去除滤渣。波长500 nm处测其吸光度值，计算花色苷含量。

水浴温度对树莓花色苷提取量的影响：将解冻后的红树莓研磨，准确称量5.0 g匀浆，加入35 mL经盐酸酸化的体积分数80%的乙醇溶液（pH 3），分别在40～60 ℃恒温水浴浸提1 h，过滤去除滤渣。波长500 nm处测其吸光度值，计算花色苷含量。

浸提时间对树莓花色苷提取量的影响：将解冻后的红树莓研磨，准确称量5.0 g匀浆，加入35 mL经盐酸酸化的体积分数80%的乙醇溶液（pH 3），50 ℃水浴分别浸提30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min过滤去除滤渣。波长500 nm处测其吸光度值，计算花色苷含量。

1.3.4 响应面优化试验

以通过单因素试验确定响应面优化试验的各因素水平，花色苷提取量（Y）为响应值，试验设计见表2。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的测定

根据1.3.2的试验方法得到树莓花色苷吸收波长，结果见图1。

图1 红树莓花色苷吸收图谱Fig.1 The anthocyanins absorption spectrum of red raspberry

由图1可知，红树莓花色苷的最大吸收波长为500 nm，因此在后续试验中，采用在波长500 nm处的吸光度值作为计算依据。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 料液比对树莓花色苷提取量的影响

红树莓样品5.0 g，提取过程中控制体系温度50 ℃、提取时间60 min，分别按1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g∶mL）料液比加入经盐酸酸化的体积分数80%的乙醇溶液（pH 3），料液比对花色苷含量的影响结果见图2。由图2可见，料液比在1∶5～1∶7（g∶mL）范围内时，随着料液比的增加，花色苷含量也随之增加；料液比＞1∶7（g∶mL）时，花色苷含量开始减少。因此，确定提取红树莓花色苷的最佳料液比为1∶7（g∶mL）。

图2 料液比对花色苷含量的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on anthocyanins content

2.2.2 水浴温度对树莓花色苷提取量的影响

红树莓样品5.0 g，按料液比1∶7（g∶mL）加入经盐酸酸化的体积分数80%的乙醇溶液（pH 3），提取时间60 min，分别选择提取温度40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃水浴提取，提取温度对花色苷含量的影响结果见图3。由图3可见，随着提取温度的升高，体系中的花色苷含量并不是持续升高的趋势，当温度达到50 ℃时，花色苷含量达到峰值随后又开始下降，为了避免树莓中花色苷因温度过高而分解，所以选择提取温度50 ℃为宜。

图3 提取温度对花色苷含量的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on anthocyanins content

2.2.3 浸提时间对树莓花色苷提取量的影响

红树莓样品5.0 g，按料液比1∶7（g∶mL）加入经盐酸酸化的体积分数80%的乙醇溶液（pH 3），提取温度50 ℃，设置提取时间分别为30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min。提取时间对花色苷含量的影响结果见图5。由图4可知，提取时间对花色苷的提取较明显，整体呈现先上升后下降的趋势，在30～60 min内，花色苷含量上升趋势较明显；而在60 min后开始缓慢下降，这可能是由于花色苷收到长时间热效应的影响导致其分解[12]。所以，选择提取时间为60 min。

图4 提取时间对花色苷含量的影响Fig.4 Effect of extraction time on anthocyanins content

2.3 响应面优化结果与分析

2.3.1 模型的建立与分析

依据方法1.3.4进行Box-Behnken试验，试验设计与结果见表3。

利用Design Expert软件对表3的花色苷含量进行方差以及回归分析，得到响应值与各变量之间的回归方程为：

表3 Box-Behnken试验设计与结果Table 3 Results of response surface experiments

为了检验方程的有效性，对该数学模型进行方差分析[13]，回归方程方差分析结果见表4。由表4可知，一次项中，A（料液比）、C（提取时间）对试验结果影响显著（P＜0.05），B（提取温度）影响不显著（P＞0.05）；二次项中A2、B2、C2的影响均显著（P＜0.05）；经方差分析可知模型P=0.002 5＜0.05，达到显著水平，失拟项P=0.069 6＞0.05未达到显著水平，表明试验设计合理，该模型能准确的描述各变量因素与响应值之间的关系[14-16]。

表4 回归方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

2.3.2 响应面的分析与优化

通过模型方程得出的响应曲面图、等高线图结果见图5。由图5可知，料液比、提取温度两因素间的交互作用明显大于AC以及BC之间的交互作用。根据等高线的形状可判断交互作用的强弱[17]，椭圆形表示两因素之间交互作用显著，圆形表示则表示交互作用不显著[18-21]。

图5 料液比、提取温度和提取时间的交互作用对花色苷含量影响的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour line showing the effects of interactions of solid-liquid ratio,extraction temperature and extraction time on anthocyanins content

2.4 验证试验

响应面优化得到的最佳工艺条件为料液比1∶7（g∶mL）、提取温度50.93 ℃、提取时间64.73 min，此条件下得到的花色苷含量58.32 mg/100 g。实际操作过程中选择料液比1∶7（g∶mL）、提取温度51 ℃、提取时间65 min。

为了确保响应面优化条件的准确性，采用上述优化条件进行了3次验证试验，试验结果表明，该条件下得到的花色苷含量为56.45 mg/100 g，相对误差为3.2%，说明通过响应曲面法得到的参数准确可靠，具有可行性。

3 结论

从新疆树莓中提取花色苷工艺的单因素和响应曲面法分析，得到了该试验的最佳提取工艺条件为料液比1∶7（g∶mL）、提取温度51 ℃、提取时间65 min，该条件下得到的花色苷含量为56.45 mg/100 g。该研究为新疆树莓中花色苷的安全有效生产提供理论和技术依据。

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