周继文，王恒，周扬，陈文昭，汪桃芳，刘志礼，付达华

0 引言

骨肉瘤是多发于青少年的一种增殖及侵袭性极强的恶性肿瘤，早期转移是其一大特点，肺部转移成为骨肉瘤患者死亡最主要的原因。已有研究证实印尼蛇接骨草醇提取物能诱导骨肉瘤细胞凋亡，抑制其增殖［1］。在本实验中，我们进一步探讨了蛇接骨草醇提取物对骨肉瘤细胞U2-OS迁徙、侵袭力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料蛇接骨草购于江西南丰印尼蛇接骨草种植基地，提取方法见文献［1］。骨肉瘤细胞株U2-OS购自中国医学科学院肿瘤研究所，并由南昌大学第一附属医院医学中心冻存。F12型培养基购自美国Hyclone公司;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程有限公司;PBS购自北京百灵威化学试剂有限公司;胰蛋白酶冻干粉(含EDTA)购自美国Sigma公司;DMSO、MTT购自美国Sigma公司，Transwell趋化板购于Costar公司(8.0μm Pore Size)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞贴壁生长于含10%FBS的F12型培养液中，其中青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/mL，于37℃、5%CO2的饱和湿度孵育箱中培养。待细胞长至约80%满后，弃去旧培养基，以适量胰酶(0.25%胰蛋白酶:0.02%EDTA=1∶1)消化细胞，弃去消化液并加入适量培养基洗涤，再以适量培养基反复轻轻吹打后制备细胞悬液，计数，以1∶4的比例传代培养。

1.2.2 Wound healing迁徙实验取对数生长期细胞进行实验;用0.25%胰酶消化细胞，含10 g/L BSA的无血清DMEM-F12培养液重悬，调整细胞浓度5×105/mL，接种于6孔细胞培养板，予以2种不同浓度(0、40 μg/mL)的GPE作用细胞24 h后，用200 μL枪头在单层细胞表面孔中划一直线。用PBS漂洗2次以去除划下的悬浮细胞;加入无血清DMEM-F12培养液(内含1%BSA)继续培养24 h，倒置显微镜下观察划痕中细胞迁徙情况并照相;Image J分析软件进行迁徙距离测量，计算各组细胞迁徙率。不同时间重复实验6次。

1.2.3 Transwell侵袭实验将冻存于－80℃冰箱的BD matrigel基质胶40C静置24 h，使之转为液态。常规细胞培养后，终止培养，吸除血清让细胞饥饿12～24 h。包被基膜，按1∶7比例稀释Matrigel，取20μL的Matrigel，加入140μL的F12型无血清培养液，充分稀释混匀(冰浴操作)。在Transwell小室的多聚碳酸滤膜上预铺Matrigel基质胶(约60 μL/孔)，每孔加入50 μL的含10 g/L的BSA(牛血清白蛋白)的无血清培养液，37℃放置3h，室温过夜干燥。常规消化离心细胞后，用10g/L BSA(牛血清白蛋白)重悬，调整细胞浓度至1×105个/mL。在Transwell小室的上室中，分别加入150 μL的已用40 μg/mL GPE处理的细胞悬液和用正常培养基培养的细胞悬液，每孔下室加入500 μL的含血清的培养基。将小室置于37℃、5%CO2孵育箱中24 h后用棉签轻轻刮除小室内微孔膜边缘的细胞，甲醇固定15 min，再用4 g/L的结晶紫染色30 min后取出Transwell小室，PBS淋洗2遍，倒置显微镜观察细胞穿膜情况并拍照，Image J分析软件计数。不同时间重复实验6次。

1.3 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，定量数据以均数±标准差(x±s)表示。采用两独立样本t检验比较2组间细胞迁徙与侵袭差异情况，2组间方差不齐时采用Satterthwaite校正t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 印尼蛇接骨草95%醇提取物［Gynura procumbens(Lour.)MERR.extract，GPE］对骨肉瘤细胞U2-OS体外迁徙的影响wound healing实验结果显示，在200倍的镜下观察经40μg/mL GPE作用24h的平均细胞迁徙率为(33±3)%，未经GPE作用的细胞组迁徙率为(66±2)%。差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 不同浓度的GPE作用骨肉瘤细胞U2-OS后的划痕愈合镜下所见(×200)Figure 1 Wound healing pictures of the U2-OS cells after treated with GPE(×200)

2.2 GPE对骨肉瘤细胞U2-OS体外侵袭的影响通过Transwell侵袭实验分析显示，40 μg/mL GPE处理的细胞24 h穿膜细胞数平均为(18±2)个/视野，未经GPE作用的细胞平均穿膜细胞数为(46±2)个/视野，两者差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

图2 Transwell侵袭实验代表图(结晶紫染色法×400)Figure 2 Representative images of Transwell invasion assay of the U2-OS cells after treated with GPE(Crystal violet staining×400)

3 讨论

骨肉瘤是一种高度恶性的骨肿瘤，其发病率在儿童及青少年的原发骨肿瘤中占据首位。虽然新辅助化疗药已使用，但近30年来骨肉瘤患者总体生存率没有得到了提高，主要原因是早期发生肺部转移和获得性耐药［2－3］。因此，新的抗骨肉瘤药物的出现是亟待解决的热点。印尼蛇接骨草广泛分布于包括中国、印度尼西亚等东南亚国家，在民间被认为具有抗癌作用而广泛作为中药和食物食用。目前药理学证明其具有抗炎、抗病毒、抗高血压、降血脂、降血糖等作用［4－8］，但其是否具有抗肿瘤效果目前少见报道。我们前期研究发现，GPE能诱导骨肉瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖［1］，但是否具有抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用未见报道。最近研究发现蛇接骨草乙醇提取物能在人成纤维细胞中抑制紫外线诱导的基质金属蛋白酶的表达［9］。目前研究已证实基质金属蛋白酶是细胞基底膜及外基质降解过程中不可缺少的一类酶，并且大量的研究表明在肿瘤组织中基质金属蛋白酶异常高表达，可作为预测肿瘤侵袭转移的指标［11－13］，而基膜及细胞外基质的降解破坏在骨肉瘤侵袭转移中至关重要，被认为是骨肉瘤侵袭转移的关键环节。我们的研究结果表明，经40 μg/mL GPE作用后的细胞细胞迁徙率和侵袭力明显低于未经GPE作用的细胞，这提示GPE能有效抑制骨肉瘤细胞迁徙侵袭。

药用植物在肿瘤的治疗中发挥作用的机制复杂。本研究中，GPE是由多种成分组成的混合物，其抗肿瘤作用是由1种还是由多种成分协同作用产生，活性成分及其作用靶点分别是什么，都有待于进一步研究。

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