刘阳，高德玉，张萍，徐敏，李晓军

0 引言

分化抑制因子又称DNA结合抑制因子(inhibitors of differentiation/DNA binding，Id)，属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)转录因子家族成员之一，其本身缺乏DNA结合必需的碱性结构域，与碱性HLH(basic helix-loop-helix，bHLH)结合成异二聚体后，可抑制bHLH与DNA及其他组织特异性bHLH结合，从而负调节bHLH转录因子，抑制细胞分化。目前共发现4种Id分子，即Id1、Id2、Id3和Id4，在真核生物中，Id蛋白在胚胎发育、细胞生长、肿瘤血管形成、侵袭和转移等方面发挥重要调控作用［1］。

Id3基因参与多种细胞生物学过程［2］，包括淋巴细胞成熟和发育、血管内皮和平滑肌细胞增殖和分化、胚胎心血管及神经系统发育和形成等［3］。Id3在细胞中的表达模式和调控机制与Id1不完全相同，Id3在不同类别的肿瘤组织和肿瘤细胞系中具有截然不同的表达模式，在原发性结直肠癌、小细胞肺癌细胞中呈高表达［4］，而在甲状腺癌、卵巢癌、前列腺癌中表达水平低下［5］;在肝病或肝癌中，其表达模式更加复杂，在分化良好的肝癌细胞中Id3的表达水平高于分化不良的肝癌细胞［6］。

为进一步探讨Id3基因在肺腺癌细胞中的作用，本实验在前期构建真核表达载体pEGFP/Id3的基础上，观察Id3转基因表达对A549细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡的影响，为进一步研究Id3对A549细胞功能的影响及其分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料人肺腺癌A549细胞由南京军区南京总医院中心实验科保存，PCR仪由eppendorf公司生产，荧光倒置显微镜购于Olympus公司，RT-PCR试剂盒购自Fermentas公司，TRIzol试剂购自Takara公司，质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，DMEM培养基、胎牛血清购自Hyclone公司，OPTI MEM购自GIBCO公司。CCK-8试剂盒购自Dojindo公司，DAPI染色液和hoechst 33258染色试剂盒购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染A549细胞培养于含10%胎牛血清，100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基中(37℃、5%CO2)。将细胞按照2×105个/孔接种于12孔板，待各孔细胞达到80%～90%融合，按照说明书用LipofectamineTM2000试剂盒将细胞分为3组进行处理:①pEGFP/Id3转染组;②pEGFP转染组;③空白对照组。转染20 h后，用荧光显微镜观察转染效率。

1.2.2 RT-PCR检测各组细胞Id3基因的表达转染20 h后，用TRIZOL试剂提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度后用反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA，PCR扩增Id3基因，Id3引物:上游:5′-ATGAAGGCGCTGAGCCCGGTGC-3′;下游:5′-ACGGCCGAGTCAGTGGCAAAAGC-3′。扩增产物大小为360 bp。GAPDH引物:上游:5′-CAACTAAGCGGCACAGAATG-3′;下游:5′-GCCAGTGGACTCCACGAC-3′，产物大小为180 bp。PCR扩增后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统进行拍照。

1.2.3 细胞划痕试验将A549细胞按2×105个/孔的密度接种于12孔板，待每组细胞达到80%～90%融合，用1.2.1所述方法将细胞分为3组进行转染，20 h后，荧光显微镜观察转染效率，用200 μL移液器枪头在培养板的孔中央划一条直线，无菌PBS清洗2遍，洗去漂浮的细胞，每孔加1000μL无血清的DMEM培养基，继续培养48h后，倒置显微镜下观察、拍照。每个孔观察5个视野，每组3个复孔，实验重复3次。

1.2.4 体外侵袭能力测定将A549细胞按上述方法转染12 h后，收集各组细胞，在12孔板的每孔加1500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，将NUNC插入式细胞培养器小室放入12孔板中，调整细胞数为1×105个/孔，每个小室加700 μL无血清培养基的细胞悬液，每孔设3个复孔，37℃、5%CO2培养24 h后，取出小室，用棉签将小室上表面的细胞轻轻擦掉，用4%多聚甲醛固定20 min，然后用苏木精染色20 min，在倒置显微镜下观察上、下、左、右、中5个视野，计数，计算平均值。

1.2.5 明胶酶谱法将A549细胞接种6孔板，按上述方法进行转染20 h后，将培养基换为无血清培养基继续培养30 h，收集上清液，进行蛋白定量后，将各组蛋白浓度调整至一致，与上样缓冲液混合，于4℃在含0.1%明胶的SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，电泳结束后，将凝胶置于含2.5%Triton X-100的洗脱液中振荡洗脱2次，每次40 min，然后用漂洗液漂洗2次，每次20min，将凝胶置于孵育液中37℃孵育40 h。考马斯亮蓝染液染色3 h，脱色至出现负染条带。凝胶成像系统进行拍照并使用Quantity One软件进行分析。

1.2.6 平板克隆形成试验按上述方法将A549细胞在6孔板中培养并转染，20 h后，将细胞消化并计数，并将每组细胞按200个/皿的浓度接种于培养皿中，轻轻摇动，使细胞分布均匀，置37℃、5%CO2环境静置培养2～3周直至出现肉眼可见的克隆。弃上清，加4%多聚甲醛固定20min，去固定液，加适量苏木精染液染10 min。用流水缓慢洗去染液，空气干燥并计数克隆。用下列公式计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%

1.3 统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，数据用均数±标准差(x±s)表示，组间均数比较用单因素方差分析，多组数据之间的两两比较用LSD-t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Id3-EGFP在A549细胞中的表达分析将细胞分组转染20 h后，于荧光显微镜下观察，发现转染pEGFP/Id3和pEGFP后细胞呈现绿色荧光，而未转染EGFP的细胞无绿色荧光，pEGFP/Id3转染细胞的荧光主要表达于细胞核，pEGFP转染细胞的荧光则均匀表达于细胞质，见图1。RT-PCR结果显示，pEGFP/Id3组细胞Id3 mRNA的表达量明显高于pEGFP组细胞和空白对照组细胞，见图2。Quantity One分析软件进行灰度分析结果显示，pEGFP/Id3转染组的Id3/GAPDH为1.274±0.035，较pEGFP转染组(0.584±0.011)和空白对照组(0.636±0.035)明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，而pEGFP转染组和空白对照组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 荧光倒置显微镜观察转染后EGFP的表达情况(×400)Figure 1 Expression of EGFP after transfection by fluorescence microscopy(×400)

图2 RT-PCR检测转染后各组细胞Id3 mRNA的表达量Figure 2 Expression of Id3 observed by RT-PCR

2.2 Id3基因表达对A549细胞迁移能力的影响细胞划痕试验结果显示，对转染细胞划痕48 h后，pEGFP/Id3转染组的细胞迁移数［(113.75±25.04)个］明显低于空白对照组［(254.75±41.06)个］和pEGFP转染组［(228.25±26.84)个］，差异有统计学意义(P＜0.01)，pEGFP转染组细胞和空白对照组细胞迁移率差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 Id3基因表达对A549细胞体外侵袭能力的影响细胞转染20 h后，pEGFP/Id3转染组穿膜细胞数［(57.00±9.88)个］明显低于空白对照组［(88.00±14.81)个］和pEGFP转染组［(83.71±19.11)个］(P＜0.01)。pEGFP组与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)，提示Id3转基因表达能减弱A549细胞的体外侵袭性。

2.4 Id3基因表达对基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)和MMP9活性的影响将细胞进行分组处理后，收集上清液进行明胶酶谱试验，条带的强弱能够半定量地反映明胶酶活性的大小。用Quantity One分析软件进行灰度分析结果显示:pEGFP/Id3转染组MMP2和MMP9灰度明显低于pEGFP转染组和空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。而pEGFP转染组和空白对照组的MMP2和MMP9的灰度值差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1、图3。

表1 各处理组MMP2和MMP9灰度分析结果比较(x±s)Table 1 Comparison of gray level analysis results for MMP2 and MMP9 from each group(x±s)

图3 Id3基因对MMP2和MMP9活性的影响Figure 3 Effects of Id3 on the activity of MMP2 and MMP9

2.5 平板克隆形成数判定细胞群体依赖性和增殖能力通过计数细胞集落形成的数目发现转染外源性Id3基因可抑制A549细胞群体依赖性生长作用。与空白对照组相比，pEGFP/Id3转染组的克隆形成率明显降低［(37.83±4.16)%vs(15.67±5.75)%，P＜0.05］，而pEGFP转染组克隆形成率［(31.17±3.40)%］与对照组相比则差异无统计学意义。见图4。

图4 外源性Id3基因可抑制A549细胞集落的形成Figure 4 Inhibitory effect of exogenous Id3 on the formation of cell colony

3 讨论

肺腺癌是呈腺管样或乳头状结构的肺部恶性肿瘤，约占肺癌的20%～30%，可较早发生转移，女性相对多见，目前该病的病因及发病机制尚未完全明确。分子靶向治疗已经成为目前肺癌治疗研究的热点［7-8］，Id分子除了具有促进细胞周期进程，抑制细胞分化的功能外，还具有更特殊多样的生物学作用。Id3表达调控机制的复杂性决定了其功能的多样性，不同的刺激因素诱导不同来源和不同发育阶段的细胞，可通过不同的信号转导途径和机制调节Id3的表达。本研究通过将外源性Id3基因转染A549细胞，以观察Id3基因过表达对人肺腺癌细胞生物学活性的影响。

肿瘤转移是由一系列复杂的生物学过程组成，这一过程是由细胞和基因2个水平所控制，而基因水平的控制更为关键，肿瘤转移相关基因的过表达与肿瘤转移抑制基因的表达不足，是引起肿瘤转移的主要原因。通过体外侵袭迁移模型我们发现转染Id3基因后穿膜细胞数明显减少，同时向“伤口”迁移的能力也明显减弱。MMPs是是依赖Zn2+的内肽酶大家族的一员，MMPs几乎可以降解细胞外基质的所有蛋白成分［9］，MMPs参与了很多生物活性因子如细胞因子、趋化因子和生长因子的形成，能调节肿瘤微环境并参与了早期的肿瘤发生、侵袭和转移过程［10］，明胶酶谱试验中SDS可与样品中的MMPs结合，从而使其不能发挥分解明胶的作用，当置Triton中洗脱后可使其恢复活性。实验结果显示各组细胞均可检测到MMP2和MMP9，且转染Id3基因后MMP2和MMP9活性显著下降，表明Id3基因可以下调A549细胞MMP2和MMP9的表达，结合“划痕”试验、Transwell试验和明胶酶谱试验的结果，我们可以得出Id3转基因表达可以减弱A549细胞的侵袭和转移能力的结论。

Id3基因对不同细胞的增殖有不同的作用，如Id3可促进乳腺癌MCF-7细胞增殖［11］，但也有研究表明，骨髓基质细胞产生骨成形蛋白-6和转化生长因子-β，可通过上调Id3 mRNA的表达而抑制细胞增殖，可阻止B淋巴细胞形成［12］。Lee等［13］发现Id3可抑制人胰腺β细胞P57Kip2表达，但是并不能促进细胞增殖。通过平板克隆形成试验我们发现，转染外源性Id3基因后，细胞的克隆形成能力显著下降，故认为Id3的转基因表达对A549细胞增殖呈抑制作用。

上述研究结果表明Id3基因可减弱A549细胞的迁移和侵袭能力，同时还有抑制A549细胞增殖能力的作用。我们下一步将以此为基础，通过基因芯片的方法，深入研究Id3转基因表达前后的基因差异，从中找出影响细胞生物活性的关键因子，为肺癌的基因治疗提供一个新的思路和靶点。

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